材料和试剂
1. 移液器吸头（过滤）（Sarstedt） 2. 注射器 1 mL，带 26 G 针头（BD Plastipak） 3. 细胞刮刀，不含 DNase/RNase（Techno Plastic Products） 4. 不含 RNase 的 1.5 mL 微管（Carl Roth，目录号： CNT2.1) 5. 不含 RNase 的 1.5 mL 琥珀色微管（Carl Roth，目录号：ENH0.2） 6. 15 cm细胞培养皿（ Sarstedt，目录号： 83.3903 ） 7. 3.5 cm 细胞培养皿（ Sarstedt，目录号：82.1135.500） 8. C201R /+小鼠 (C3H.C-GarsC201R/H ) （阿奇利等人，2009） 9. 293 (HEK293) 细胞系293 (HEK293) (ATCC CRL-1573 TM ) 10. Gibco Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（DMEM）（Pan Biotech，目录号： P04-03500 ) 11. 胎牛血清（FBS）（Pan Biotech，目录号： P30-3302 ) 12. L-谷氨酰胺（Serva，目录号： 22942 ） 13. PBS（ Gibco TM ，目录号：70011044） 14. 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（Pan Biotech，目录号： P10-019500 ) 15. Triton ® X-100（Sigma，目录号：T9284） 16. Tris Base（Sigma，目录号：T6066） 17. 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物（罗氏，目录号：11873580001） 18. 尿素（Carl Roth，目录号： 57-13-6 ） 19. NaCl（Carl Roth，目录号：HN00.2） 20. 酸 - 苯酚：氯仿，pH 4.5（Invitrogen，目录号：AM9720） 21. 3 M乙酸钠，pH 5.2（Carl Roth，目录号：6773.2） 22. 糖原（Invitrogen，目录号：AM9510） 23. 无水乙醇（Carl Roth，目录号： 9065.4 ) 24. 异丙醇（Carl Roth，目录号：7343.2） 25. 40% 聚丙烯酰胺（Carl Roth，目录号： A516.1 ) 26. RNase抑制剂SUPERase-In （Invitrogen，目录号：AM2694） 27. NP-40（Sigma，目录号：6507） 28. DTT （Carl Roth，目录号：6908.2） 29. SDS（Carl Roth，目录号： CN30.3) 30. 脱氧胆酸钠洗涤剂（SDC）（ Thermo，目录号：89904） 31. EDTA（AppliChem，目录号：A5097,1000） 32. BSA（Carl Roth，目录号： T844.3） 33. 柠檬酸三钠（Carl Roth，目录号：3580.1） 34. Hybond-N 膜（GE Healthcare Life Sciences， RPN2250B ） 35. T4 DNA连接酶（NEB，目录号：M0202） 36. DMSO（Sigma，目录号：D8418） 37. 鲑鱼精子DNA（Invitrogen，目录号：15632011） 38. 抗 GARS 抗体（ Abcam，目录号：ab42905； Proteintech，目录号：15831-AP） 39. Pierce 蛋白 G 磁珠（Thermo，目录号：88847） 40. RevertAid H Minus 逆转录酶（Thermo，目录号：K1631） 41. 10 mM DNTP（Thermo，目录号：R0181） 42. T7 RNA聚合酶（Thermo，目录号：EP0113） 43. NTP （Thermo，目录号：R0481） 44. 粉碎和浸泡缓冲液（见食谱） 45. 2 × RNA 负载甲酰胺染料（见配方） 46. 20 ×柠檬酸钠盐缓冲液（SSC 缓冲液；见配方） 47. 细胞裂解缓冲液（参见配方） 48. 组织裂解缓冲液（见配方） 49. 用于细胞培养的洗涤缓冲液（参见配方） 50. 组织洗涤缓冲液（参见食谱） 51. 1 × SDS 缓冲液（参见配方） 52. 杂交缓冲液（见配方）注：除抗 GARS 抗体外，所有其他试剂均可从任何其他供应商处购买。
设备
1. 标准分子生物学设备 2. UV交联剂（Analytik Jena，目录号：CL-1000） 3. CellCrusher 组织粉碎机（Kisker，目录号：538004） 4. Eppendorf管旋转器（Eppendorf，目录号：R5010） 5. 紫外-可见分光光度计 (DeNovix DS-C) 6. ChemiDoc TM MP 成像系统多重荧光、化学发光（Bio-Rad） 7. 磁珠分离器（Thermo Fisher，目录号：CS15000） 8. Jess 自动化蛋白质印迹系统（Protein Simple）
软件
1. 斐济 ImageJ（ImageJ， https: //imagej.net/software/fiji/ ） 2. 用于简单西方的指南针软件（Protein Simple，一个生物技术品牌， https://www.proteinsimple.com/software_compass_simplewestern.html ）
程序
笔记： a. 起始材料可以是任何感兴趣的组织，或内源性表达、稳定转染或异位表达感兴趣的tRNA相互作用蛋白的哺乳动物细胞培养物。建议在组织中进行实验之前，使用易于获取的材料（例如细胞培养）测试和优化协议。 b. 对于定量评估，重要的是在多个独立的生物复制中进行实验，即至少≥4 以进行统计评估。 c. 所有步骤都应在无 RNase 的环境中执行。
A. 样品制备
一个。体内紫外交联以稳定细胞培养中的瞬时 tRNA-蛋白质相互作用（此处为 HEK293T 细胞，以下仅命名为 HEK） 1. 在 37°C 下，在 15 cm细胞培养皿中的 DMEM 中培养 HEK 细胞，并在 5% CO 2中添加 10% FBS 和2.5 mM L-谷氨酰胺。注意：对于一项实验，大约需要 2000 万个细胞。然而，对于几乎没有可用的细胞培养材料，可以使用少至 600 万个细胞。 2. 要准备细胞进行 UV 交联，请吸出培养基并轻轻加入 5 mL 的冷 1 × PBS。注意：PBS 体积应在每个实验中进行调整。它应该最少，但足以覆盖贴壁细胞培养中的标本或板表面。 3. 将细胞培养板放在冰上，用交联剂的紫外光源（254 nm）以 150 mJ/cm 2辐射照射。注意：平行地，以相同方式处理但没有 UV 交联（即省略步骤 3）的细胞可用作对照。 4. 将细胞培养皿放在冰上，轻轻吸出 PBS 溶液，加入 800 μL 的预冷细胞裂解缓冲液。使用细胞刮刀收获细胞并将其转移到预冷却的 1.5 mL Eppendorf 管中。 5. 使用带有 26 号针头的 1 mL 注射器，将裂解液通过 8 次，以进一步剪切打开细胞并促进裂解。要获得澄清的裂解物，请在 16,000 × g和 4°C 下离心 10 分钟。这是 IP 的起始材料（步骤 Ca）。
湾。体内紫外交联以稳定组织样本中的瞬时 tRNA-蛋白质相互作用注意：要选择最适合实验的组织，可以参考人类蛋白质图谱。在我们的实验中，我们使用来自 3 至 6 周龄 CMT 模型小鼠的脑组织（ Gars C201R /+ ； Achilli 等人，2009）并将其与野生型同窝仔鼠（即表达 WT GlyRS 的小鼠）进行比较。 C57Bl/6J ). Gars C201R /+ 小鼠携带 ENU 诱导的显性点突变，导致 GlyRS 蛋白的残基 201 处半胱氨酸取代为精氨酸。 GarsC201R 小鼠的杂合原种菌落维持在 C57Bl/6J 背景中。小鼠脑组织的一个半球足以获得足够量的 tRNA 和 GlyRS 用于 IP 。对于几乎不表达的感兴趣的蛋白质，可以汇集来自几种动物（最好是同窝仔）的器官。
1. 将新鲜解剖的脑组织样本快速冷冻在液氮中，并在预冷的 CellCrusher 组织粉碎机中粉碎。将粉碎的组织转移到放置在冰上的 3.5 cm 细胞培养皿中。注意：使用同质组织粉末，因为团块和较大的组织块会限制交联效果。 2. 将盘子放在 UV 交联剂内的 UV 光源 (254 nm) 下的冰浴上，并施加 400 mJ/cm 2辐射。注意：根据组织的可用性，还应使用非交联控制。 3. 添加 500 μL 的冷组织裂解缓冲液并通过上下移液进行机械剪切，使用预冷却的大口径移液器吸头（或末端切出的 1，000 μL 移液器吸头）。 4. 加入500 µL 冷裂解缓冲液，并在 4°C 下搅拌 1 小时。通过在 16,000 × g和 4°C下离心 10 分钟来清除裂解物。这是 IP 的起始材料（步骤 Cb）。
B. 磁珠的制备和抗体偶联注意：根据要用于 IP 的抗体的免疫球蛋白 (Ig) 类型选择磁珠。
一个。对于 HEK 细胞裂解物 1. 使用蛋白 G 偶联 Dynabeads ® 。每次抗体偶联反应使用 20 μL的珠浆。 2. 将带有珠子的管子放在磁分离器上，用 500 μL的冷 1 × PBS 洗涤两次，然后将它们重新悬浮在 50 μL的细胞裂解缓冲液中。 3. 在珠子中加入 2 μg 抗体，并在室温下在管旋转器上孵育 45 分钟。制备裂解液时置于冰上（步骤 Aa）。
湾。用于脑组织裂解物 1. 使用蛋白 G 偶联 Dynabeads ® 。每次耦合反应使用 50 μL的珠浆。 2. 准备珠子，用 500 μL的冷 1 × PBS 溶液洗涤两次，然后将它们重新悬浮在 100 μL的组织裂解缓冲液中。 3. 在珠子中加入 4 μg 抗体，并在室温下在管旋转器上孵育 45 分钟。制备裂解液时置于冰上（步骤 Ab）。注意：对于我们在细胞培养和小鼠组织中的实验，我们使用了两种不同抗 GlyRS 抗体的混合物，我们以等量混合（例如，对于 HEK 样品或小鼠脑裂解物，分别为 1 或 2 µg） .使用来自不同供应商的抗体混合物可提高不同供应商收费之间的 IP 可重复性。
C. 免疫沉淀 (IP) 注意：为了确定抗体的效率，我们建议首先使用更容易获得的材料（例如细胞培养物）进行下拉，从而优化带有偶联抗体的珠子的数量和 IP 孵育时间。对于孵育时间，我们建议从 1 小时或几个小时开始，直至过夜孵育。最佳孵育时间将是抗体最大限度保留所需靶标的时间，在溴化乙锭染色的变性聚丙烯酰胺凝胶上可检测到最少或没有非特异性 RNA 条带。
一个。对于 HEK293 细胞裂解物 1. 将步骤 5A-a（约 800–900 μL）中获得的清除上清液添加到准备好的珠子（步骤 B-a3）中。 2. 加入 20 U 的 RNase 抑制剂 (SUPERase-IN) 并在 4°C 下旋转 2 小时。 3. 将管子放在磁分离器上，以分离与抗体偶联珠结合的免疫沉淀 tRNA-GlyRS。小心丢弃上清液。 4. ×洗涤缓冲液洗涤珠子两次，用于细胞培养，并将它们重新悬浮在 500 μL 的洗涤缓冲液中进行细胞培养。 5. 在步骤 E 中取出 10 μL 的 IP 反应（珠子）并保持在冰上进行蛋白质定量。 6. 直接在珠子上对剩余的 IP 样品进行热酸-苯酚提取，以使蛋白质（此处为 GlyRS）变性并洗脱结合的 tRNA。注：简而言之，热酸性苯酚提取的步骤：加入1体积的酸性苯酚：氯仿（5：1，pH 4.5）预热至65°C和0.1体积的10% SDS反应，孵育5分钟，然后在冰上孵育 5 分钟。以 21,000 × g 离心 5 分钟，除去水相并加入等体积的酸性苯酚：氯仿。在室温下孵育，然后以 21,000 × g 离心 5 分钟。收集水相并加入等体积的氯仿：异戊醇 (24:1) 和 0.1 体积的 3 M NaOAc (pH 5.5)。以 21,000 × g 离心 5 分钟以收集最终的水相。用异丙醇沉淀水相中的 RNA。 7. 将回收的 tRNA 溶解在 5 μL 的无菌无核酸酶水中。
湾。对于脑组织裂解物： 1. 将步骤 A-b4 中获得的澄清上清液添加到制备好的珠子中（步骤 B-b3）。 2. 添加 20 U 的 RNase 抑制剂并在 4°C 下旋转过夜。 3. 将管子放在磁分离器上，以分离免疫沉淀的 tRNA-GlyRS 耦合珠。小心丢弃上清液。 4. ×组织洗涤缓冲液洗涤两次，并将珠子重新悬浮在 500 μL 的组织洗涤缓冲液中。 5. 在步骤 E 中取出 10 μL 的 IP 反应（珠子）并保持在冰上进行蛋白质定量。 6. 对剩余的 IP 进行热酸-苯酚提取，以使蛋白质（此处为 GlyRS）变性并洗脱结合的 tRNA。 7. 将回收的 tRNA 溶解在 5 μL 的无菌无核酸酶水中。
D. IP 中结合 tRNA 的鉴定和定量
一个。检测方法一：northern blot tRNA鉴定注意：需要体外转录的感兴趣的 tRNA 作为阳性对照。在这里，tRNA Gly GCC 是通过标准 T7-RNA 聚合酶径流转录反应制备的，使用如前所述的 DNA 模板 ( Albers et al., 2021) 。设计了两个部分重叠的 DNA 引物以覆盖全长 tRNA Gly GCC，正向引物的 5' 端带有 T7 启动子位点（ 5'-TAATACGACTCACTATA-3'；表 1）。两种引物（各 100 µM）均溶解在 20 mM Tris-HCl（pH 7.5）中，在 95°C 下变性 2 分钟，在室温下孵育 3 分钟，使其重叠部分退火。引物延伸在 37°C 下进行 40 分钟，使用 0.4 mM dNTPs 和 4 U/μL RevertAid H Minus Reverse Transcriptase。双链 DNA (dsDNA) 通过苯酚/氯仿和乙醇沉淀纯化，溶解在 DEPC-H 2 O 中。 dsDNA 模板的体外 T7 启动子转录在 37°C 下过夜，0.6 U/ μL T7 RNA 聚合酶，存在 2 mM NTP、5 mM GMP 和 1 ×转录缓冲液。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化转录的tRNA。从凝胶中切下tRNA并在粉碎和浸泡缓冲液中洗脱，在 100 × g和 4°C 下旋转过夜。通过在 3500 下离心沉淀凝胶块 × g 5 分钟，用乙醇沉淀 tRNA。
体外T7 启动子驱动合成 tRNA Gly GCC的 DNA 引物示例。正向引物在 tRNA 转录起始位点的 5' 上游包含 T7 启动子（下划线）。向前 5'- TAATACGACTCACTATA GCATCGGTGGTTCAGTGGTAGAATGCTCGCCTGCCACGCGGGC-3' 撤销 5'-TGGTGCATCGGCCGGGAATCGAACCCGGGCCGCCCGCGTGGCAGGCGAGCATTCTA-3'
1. 为了准备从 IP 样品中回收的 RNA（步骤 C-a7 或 C-b7）用于 Northern 印迹分析，将样品与 RNA 上样染料混合，在 95°C 加热 3 分钟，然后将其置于冰上。 2. 将样品加载到 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶上，并在 10 W 下运行 30 分钟。体外合成的 tRNA 也加载在凝胶上作为阳性对照（图 2A 和 3A）。 3. 将 RNA 从凝胶转移到 Hybond-N 印迹膜上，使用预冷的 0.5 × TAE 缓冲液在 10 V 和 4°C 下过夜。 4. 通过以 365 nm 和 999.9 mJ/cm 2剂量照射将 RNA 固定在膜上。将膜与 Atto565 标记的 DNA 寡核苷酸探针（5 µL 的 100 µM 探针）杂交，在 28°C 的杂交缓冲液中识别感兴趣的 tRNA。注意：如果 tRNA 结合蛋白结合一个 tRNA 家族的所有 tRNA 异受体（所有 tRNA 识别给定氨基酸的不同密码子，因此被相同氨基酸氨酰化），我们建议对所有异受体使用探针混合物.在这里，我们使用了两种探针，其中一种具有可识别所有三种 tRNA Gly同工受体的简并核苷酸序列（表 2）。两种探针都用相同的 Atto-565 荧光团标记。然而，可以选择用单独的荧光团标记的探针混合物。制造商对探针的 5' 端进行荧光标记。 5. 清洗三次，辅以 0.1% SDS。 6. × SSC洗涤一次。 7. × SSC洗涤一次。 8. 用 0.2 × SSC 洗涤一次。 9. 在 ChemiDoc TM上成像印迹 MP成像系统。
表 2. 在 Northern 印迹实验中使用的 Atto565 标记的 DNA 探针的序列。一种探针包含简并碱基，因此可以识别 tRNA Gly CCC 和 tRNA Gly GCC。探针的 5' 末端用 Atto565 标记。探测顺序 tRNA Gly TCC 5'-CCCGGGTCAACTGCTTGGAAGGCAGCTAT-3' tRNA Gly CCC/GCC 5'-GYCTCCCGCGTGGSAGGCGAG-3'

湾。检测方法 2：通过荧光 tRNA 标记对与 GlyRS 结合的 tRNA 进行定量注意：IP（步骤 C）产生足够的 RNA，用于通过 Northern 印迹和荧光定量检测 tRNA。由于 Northern 印迹仅用于 tRNA 鉴定，我们建议在单个生物复制中进行，方法是将整个剩余提取的 tRNA 量加载到多个孔中 [例如，2 个具有等量样品的孔（图 2B）] 到凝胶上，并将它们用作多个技术复制品，以平均荧光定量步骤中的信号。
1. 步骤 C-a7 或 C-b7中的 tRNA：具有以下序列的 tRNA 特异性 DNA 发夹寡核苷酸： 5'-p CGCACUGCdTdTdT Cy3 dTdTdGdCdAdGdTdGdCdGdTdGdGdN -3'或 p CGCACUGCdTdTdT Atto647 dTdTdGdCdGdGdTd -3 '表示脱氧核糖或DNA核苷酸，p是5'单磷酸）。 2. 对于标记，准备以下标记反应：1 µL 10 × T4 连接缓冲液（NEB，#M0202）、1.5 µL DMSO、0.5 µL Cy3 标记的 25 聚体寡核苷酸（90 µM）、0.5 µL T4 DNA 连接酶和 1.5 µL的 DEPC-H 2 O。注意：荧光标记的 RNA：DNA 发夹寡核苷酸旨在与 tRNA 的独特未配对 3'-NCCA 末端进行碱基配对，并用于专门标记 tRNA，如前所述（Kirchner 等人，2017 年）。 3. 5 µL提取的 tRNA（步骤 C-a7 或 C-b7）与 5 µL上述标记混合物（步骤 D-a2 或 D-b2）混合，在 25°C 避光孵育 1 小时，以保护荧光团。 4. 将连接混合物在 95°C 加热 3 分钟，然后立即将其置于冰上。 5. 在 10 W 的 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶上在黑暗中运行 30 分钟。 6. 可视化 ChemiDoc TM MP 成像系统上的 tRNA，并保存高质量的图像以进一步量化荧光 tRNA 条带（代表性图像如图 2B 和 3B 所示）。
E. IP 中 GlyRS 蛋白的定量。 1. 使用步骤 C-a5 或 C-b5 中保留的 10 µL IP 样品。使用磁性架将带有结合抗体和蛋白质-tRNA 复合物的珠子从液相中分离出来。 2. 中加入 10 µL 1 × SDS 缓冲液，在 50°C 下轻轻摇动孵育 10 分钟。 3. 使用磁力架收集磁珠，然后将溶液转移到新的 Eppendorf 管中——这种洗脱液由结合的 tRNA 相互作用蛋白组成。 4. 使用 Jess 自动蛋白质印迹系统（一种基于毛细管的自动蛋白质印迹仪器）来量化蛋白质（图 2C 和 3C）。注意：Jess (Protein Simple) 是一种自动化的高通量蛋白质印迹系统，它结合了毛细管电泳按质量分离蛋白质和通过抗体在化学发光或荧光检测模式下进行免疫检测。尽管自动化 Jess 系统提供更高的灵敏度，但也可以使用传统的蛋白质印迹法。我们使用不同浓度的纯化人野生型 GlyRS 蛋白来建立标准曲线。野生型 GlyRS 被克隆到 pET28 载体中并在大肠杆菌 Rosetta 菌株中表达。 GlyRS 序列通过两个纯化标签 6xHis 和 SUMO 进行了扩展。使用两个连续的色谱步骤将蛋白质纯化至均质，即基于Ni-NTA的亲和纯化，随后切割两个标签，并通过尺寸排阻色谱纯化。 Zuko 等人描述了详细的纯化方案。（2021 年）。
图 2. 在 HEK 细胞中建立与 GlyRS 结合的 tRNA 的实验条件和定量。 A. 使用 Atto565 标记的探针通过northern 印迹检测与GlyRS 结合的tRNA Gly ，该探针识别所有三种tRNA Gly同工受体。加载体外转录的 tRNA Gly GCC 作为阳性对照，大小为 74 nt。 UV 和无UV 分别表示用UV 和没有UV 处理的细胞。 B.用 Cy3 标记的荧光茎环 RNA/DNA 寡核苷酸对与 GlyRS 结合的 tRNA Gly进行定量。在 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶上监测连接的 tRNA 产物。荧光标记的扩展 tRNA 的大小为 98 nt。 C. 通过 Jess 自动蛋白质印迹分析 IP 的免疫印迹并用识别 GlyRS 的抗体进行探测。分析了 IP 反应的不同稀释度。蛋白质重量标记以 kDa 显示在左侧。 D. 与 GlyRS 结合的 tRNA 的定量。请注意，HEK 细胞用于优化协议，因此作为单个实验进行。 UV 交联增加了与GlyRS 结合的 tRNA Gly的产量。
图 3. Gars C201R/+小鼠 (C201R-IP) 和野生型同窝小鼠 (WT-IP)脑组织中与GlyRS 结合的 tRNA 的定量。 A.使用 Atto565 标记的探针识别所有三种 tRNA Gly同工受体，通过 Northern 印迹检测与突变型和野生型 GlyRS 结合的 tRNA Gly 。加载体外转录的 tRNA Gly GCC 作为阳性对照，大小为 74 nt。 B.用 Cy3 标记的荧光茎环 RNA/DNA 寡核苷酸对与 GlyRS 结合的 tRNA Gly进行定量。将连接的 tRNA 产物加载到 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶上。荧光标记的扩展 tRNA 大小为 98 nt。 C. 通过 Jess 自动蛋白质印迹分析 Ips 的免疫印迹并用识别 GlyRS 的抗体进行探测。分析了不同的稀释度。蛋白质重量标记以 kDa 显示在左侧。 D. tRNA 与 GlyRS 结合并标准化为野生型小鼠的 tRNA/GlyRS 比率的量化，该比率设置为 100%。数据显示为平均值±SEM（n = 5 个独立的生物学重复）。数据分析
1. 使用 ImageJ 软件从步骤 D-a6 和 D-b6（图 2A 和 3A）中的凝胶中量化 tRNA 条带的强度。将 tRNA 带的强度标准化为精确数量已知的体外转录标准 tRNA 的强度。注意：确保要比较的样品加载到相同的凝胶上，并且图像是灰度拍摄的。计算强度时使用相同的区域，并从多个技术复制中对其进行平均。凝胶中空白泳道的强度应用于减去背景信号。 2. 从 Jess 电图报告中，使用 Compass 软件 for Simple Western (ProteinSimple) 量化与感兴趣的蛋白质相对应的峰面积。使用纯化蛋白样品的标准曲线确定浓度（参见步骤 E 中的注释）。 3. 将 tRNA 的量除以蛋白质的量。注意：如果比较两种情况或突变的影响，请标准化为与野生型对照的比率，其比率设置为 1。我们使用这种额外的标准化来评估结合 tRNA 与 CMT 的增加-突变 GlyRS（图 2E 和 3E）。
食谱
1. 细胞裂解缓冲液 20 mM Tris-HCl，pH 7.4 15 毫米氯化钠 1% NP-40 0.1%海卫® X-100 1 ×蛋白酶抑制剂 2. 组织裂解缓冲液 20 mM Tris-HCl，pH 7.4 15 毫米氯化钠 1% NP-40 0.1%海卫® X-100 0.5% SDC 1 ×蛋白酶抑制剂 3. 细胞培养洗涤缓冲液 20 mM Tris-HCl，pH 7.4 100 毫米氯化钠 1% NP-40 0.1%海卫® X-100 4. 组织洗涤缓冲液 20 mM Tris-HCl pH 7.4 100 毫米氯化钠 1% NP-40 0.1%海卫® X-100 2% SDC 5. 1 × SDS 缓冲液 50 mM Tris-HCl pH 6.8 2% SDS 6. 20 × SSC 缓冲器 3 M 氯化钠 0.3 M 柠檬酸三钠 7. 杂交缓冲液 250 mM Na 2 HPO 4 ，pH 7.2 1 毫米乙二胺四乙酸 7% 安全数据表 0.5% BSA 100 µg/mL 鲑鱼精子 DNA 8. 粉碎和浸泡缓冲液（每个样品 1–5 mL） 50 毫米 KOAc 200 毫米氯化钾 pH 7.0 9. 2 × RNA 负载甲酰胺染料 9.5 毫升甲酰胺 330 毫升 DEPC 水 150 µL 1% 二甲苯氰 20 µL 0.5 M EDTA 注意：所有缓冲液都是在 DEPC 处理过的水中新鲜制成的。
致谢
这项工作得到了 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, IG73/14-2) to ZI 和 Donders 神经科学中心的支持，肌肉萎缩症协会 ( MDA479773 )、欧盟联合计划 - 神经退行性疾病研究 (JPND；ZonMW 733051075 (TransNeuro) 和 ZonMW 733051073 (LocalNMD)、Radala 基金会、AFM-Téléthon、ARSLA 和 ERC 整合资助 (ERC-2017) -COG 770244) 到 ES 这个改编的协议最初发表在我们以前的手稿中(Zuko et al. , 2021; Doi: 10.1126/science.abb3356)。
利益争夺
作者声明没有竞争利益。
伦理
小鼠实验在 Radboud 大学（荷兰奈梅亨）进行，并得到荷兰国家伦理委员会“Centrale Commissie Dierproeven”（AVD1030020184826/2017-0067）的批准。
参考
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