材料和试剂

25 × 75 mm Superfrost Plus Slides（ Diagger ，目录号：EF15978Z），在室温下储存
25 × 25-1显微镜盖玻片（ Fisherbrand ，目录号：12-542-C），室温储存
23 G 1¼ Precision Glide Needle（BD Bioscience，目录号：305120），室温储存
KimWipes （ Kimtech Science，Kimberly-Clark Professional，目录号：05511），在室温下储存
M9 Buffer（IPM Scientific，目录号： 11006-517），室温储存
10 × PBS（KD Medical，目录号： RGF-3210），室温储存
聚-L-赖氨酸溶液（Sigma Life Science，目录号：P8920-100mL），室温储存
多聚甲醛粉末（Sigma-Aldrich，目录号：158127），储存于 4°C
Triton X-100（Sigma Life Science，目录号：X100-100mL），室温储存
柠檬酸钠三水合物粉末（Sigma-Aldrich，目录号：C8532），室温储存
TUNEL Assay Kit – FITC（Abcam，目录号：ab66108），储存于 4°C 和 -20°C
DAPI粉末（Sigma-Aldrich，目录号：D9542），4°C储存
Vectashield （Vector Laboratories， Inc ，目录号：H-1000），在 4°C 下储存
显微镜用浸油（ Cargille ，目录号：16482），室温储存

库存解决方案
4% 多聚甲醛 (PFA) 溶液（参见食谱）。
PTX 溶液（见配方）
100 mM 柠檬酸钠缓冲液（参见配方）
DAPI 解决方案（见配方）
TUNEL 检测试剂盒中的 TUNEL 反应混合物（参见配方）
1 M柠檬酸钠（见食谱）
设备

SMZ645立体显微镜（尼康，型号：SMZ645-L）
数字加热块（VWR Scientific Products，目录号：13259-050）
转盘共聚焦显微镜
尼康 Eclipse Ti2-E 倒置显微镜
横河CSUZ-1转盘
光度计 Prime95B 相机
Nikon Plan Flour 40 × /1.3 油浸物镜

软件

Elements Advanced Research（尼康， https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research ）

程序

工作试剂制备
准备聚-L-赖氨酸涂层载玻片
添加 3–5 μ L Poly-L-赖氨酸到Superfrost Plus 载玻片的中心。
将聚-L-赖氨酸溶液的液滴扩散到直径约 1 厘米的均匀层中，移液管尖端的一侧。
在室温 (RT) 下干燥过夜。载玻片干燥后可在 4°C 下保存长达一个月。
在手术前让幻灯片进入 RT。
准备 4% 多聚甲醛 (PFA) 溶液（见食谱）。
准备 PTX 溶液（见配方）。
准备 100 mM 柠檬酸钠缓冲液（参见食谱）。
准备 DAPI 解决方案（参见食谱）。多余的溶液可在4°C 下避光保存长达 1 个月。

图 1. 从盘子到载玻片挑选动物。
(A) 使用铂丝拾取器，将动物从培养板中挑选到含有 M9 缓冲液的手表玻璃上。 (B) 使用扫掠动作，轻轻地将动物从拾取器中取出，放入手表玻璃中的 M9 缓冲器中。 (C) 使用扫动动作，轻轻地将单个动物从手表玻璃上提起，并将它们转移到含有一滴 M9 缓冲液的幻灯片上。 (D) 在聚-L-赖氨酸干燥床上的 M9 缓冲液滴中包含单个动物的幻灯片的代表性示意图。表示不是按比例的。

样品制备
从线虫（L4 或成人）的同步种群中，手动将个体动物挑选到含有 M9 溶液的手表玻璃中，以去除多余的细菌（图 1A 和 1B）。
将 10 μ L的 M9 溶液移至载玻片的聚-L-赖氨酸涂层区域。
单独挑选线虫进入幻灯片上的 M9 液滴（图 1C和1D）。总共向液滴中添加约 10 只动物。
注意：从手表玻璃中挑选蠕虫时，请用您的镐轻轻地将它们单独舀起。 M9 的表面张力将允许您拾取单个蠕虫。轻轻扫过载玻片上的 M9 液滴，将它们从拾取器中取出。
在幻灯片上，解剖动物的性腺
使用针的边缘，从幻灯片上的线虫切割头部和/或尾部。性腺会自动挤出并粘在聚-L-赖氨酸涂层上（图 2）。
笔记：
1）有些人喜欢使用两根针和一个剪刀动作，尽管我们发现这是不必要的。
2) 加入麻醉剂如 1mM 左旋咪唑可能会有所帮助。
3) 视频协议可在https://www.jove.com/v/20131/c-elegans-gonad-extrusion-a-rapid-dissection-technique找到 (Gervaise and Arur, 2016).
快速工作，因为所有性腺都应在两分钟内解剖。

秀丽隐杆线虫的性腺解剖。
具有 23 G 1¼ 针的线虫进行解剖显微镜的代表性图像。针尖靠近咽和肠的交界处（也由浅色变为深色表示）。这是应该做切口的地方。 (B) 通过解剖显微镜观察的挤出性腺的代表性图像。肠子也会挤出来。请注意，在这种情况下，头部并未完全移除。 (C) 已突出的第一天成年性腺的增强图像（来自 B），区域已标记。 MZ：有丝分裂区； TZ：过渡区。比例尺（A 和 B）：500 µm； (C) 100 µm。

用 PFA 修复样本
KimWipe的边缘吸走多余的 M9 溶液（图 3）。
吸取 25 μ L的 4% PFA 到样品上。轻轻添加盖玻片以防止蒸发。
在 RT 孵育 20 分钟。
小心地取下盖玻片。用吸管小心地取出 PFA并放入适当的容器中。
笔记：
1) 可能需要使用剃须刀片在盖玻片和载玻片之间形成分离。如果使用，请确保不要损坏样品。
2) PFA 是一种危险废物。根据您所在机构的指导方针处理它。在 PFA 固定后立即进行的所有 PTX 洗涤都应假定含有 PFA 并与 PFA 一起处理。
25–50 μL PTX 溶液清洗样品3 次，每次 3 分钟。使用与 PFA 相同的移液技术，以避免损坏样品。在与 PFA 相同的容器中处理 PTX洗涤液。

图 3. 固定、清洗和染色挤出性腺的示意图。
动物将被包含在一滴缓冲液中。在每个步骤结束时移取或吸走（使用KimWipe ）缓冲液。在每一步开始时用吸管添加缓冲液。为避免破坏样品，请从缓冲液滴边缘移液或吸管，如红色椭圆中的区域所示。如有必要，倾斜滑块以使吸液更容易。表示不按比例。

在准备好的柠檬酸钠缓冲液中孵育样品以改善抗原修复
吸取 25 μ L的 10 mM柠檬酸钠溶液并盖上盖玻片。
将幻灯片放在预热到 65 °C 的热块上。孵育 20 分钟。
小心地取下盖玻片。用KimWipe的边缘吸走柠檬酸钠溶液。
如步骤 5e 所示，用 PTX 洗涤 3 次。 PTX 清洗液此时不需要特殊处理。
在 TUNEL 反应混合物中孵育样品
从 TUNEL 检测试剂盒中制备 TUNEL 反应混合物（参见配方）。
吸取 51 μ L反应混合物到样品上。添加盖玻片以防止蒸发。
在 37 °C的潮湿室中孵育60 分钟。从这一点向前保护幻灯片免受光线照射。
注意：任何带有湿纸巾的塑料容器都足以制作一个潮湿的房间。如果没有自然的方法来防止载玻片直接放在纸巾上，则加入一些支撑载玻片的东西（例如两个平行的血清移液管）效果很好。
如步骤 5e 所示，用 PTX 洗涤 3 次。 PTX 清洗液此时不需要特殊处理。
DAPI 联合标记
KimWipe边缘的 Wick away PTX 解决方案。
中加入 25 μ L DAPI 溶液并在避光室温下孵育 5 分钟
如步骤 5e 所示，用 PTX 洗涤 3 次。 PTX 清洗液此时不需要特殊处理。
安装和盖滑
KimWipe的边缘吸走任何剩余的 PTX 解决方案。
将一滴Vectashield直接添加到样品中。
轻轻地将干净的盖玻片放到样品上。为避免气泡，先降低一个边缘，然后慢慢降低盖玻片的其余部分。
注意：如果存在气泡，请用牙签轻轻按压气泡，将其移至盖玻片边缘。
用KimWipe吸走多余的Vectashield 。用指甲油密封盖玻璃。
样品可以立即或第二天成像。第二天成像往往会产生更好的结果。如果等待图像，请将幻灯片存放在 4 °C。

与 DAPI 和 TUNEL 共同标记的野生型 L4线虫性腺的代表性最大强度投影。
DAPI 染色的细胞核标记为蓝色，TUNEL 阳性细胞核标记为绿色。由于这是 L4 性腺，因此不存在卵母细胞。基于核 (DAPI) 结构可辨别性腺的不同区域。由于减数分裂期间的交叉形成（双倍体），细胞核将用 TUNEL 标记。在其他系统中报道了用 TUNEL 对有丝分裂核进行人工标记，包括人体组织切片(Labat-Moleur et al., 1997)和果蝇卵巢(Qi and Calvi, 2016)。复制过程中的 DNA 缺口可能是原因(Mets and Meyer, 2009)。中间粗线期区域的明显苍白标记是将两个 z 堆栈拼接成单个图像的伪影。比例尺：100 μ m 。

共聚焦成像
准备
确保所有适当的激光器（405 nm 和 488 nm）和光源都打开并加热。将 405 nm 激光设置为 35% 功率和 100 ms曝光。将 488 nm 激光设置为 25.5% 功率和 100 ms曝光。
将载玻片安装到显微镜台上。
如果使用油浸物镜，在盖玻片上加一小滴油。
找到所需的样本。
图像采集
将 z 切片厚度设置为 0.3 微米。 _
定义 z 堆栈以包含整个种系直径。
捕获 z 堆栈。
如有必要，捕获第二个 z 堆栈以对整个生殖系进行成像。

数据分析

数据分析应根据最终最终用途由实验者自行决定。我们定性评估了 TUNEL 标记，但可以通过确定 TUNEL 阳性细胞核的百分比作为总细胞核 ( (# TUNEL+)/(# DAPI+)) 的函数或性腺特定区域（例如粗线期）内 TUNEL 阳性细胞核的百分比来产生定量测量。比较野生型和突变型样品之间 TUNEL 阳性细胞核的百分比是合适的。

笔记

增加 DSB 发生率的阳性对照是将秀丽隐杆线虫暴露于紫外线下。我们通过将带有线虫的盘子放在标准紫外线灯箱上 20 分钟来实现这一点。平板上接种了 OP50 细菌，尽管我们不认为这是明确必要的。

食谱

所有的缓冲液都是购买的。孵育和洗涤缓冲液的制备如下所示。
4% 多聚甲醛 (PFA) 溶液
在 H 2 O 中，来自 16% 的库存。用新鲜的。可能需要加热。储存在 4 °C 。
PTX 解决方案
10 × PBS 库存和 Triton X-100。 1 × PBS + 0.4% Triton X-100。用新鲜的。
100 mM 柠檬酸钠缓冲液
1 M 库存 + 0.1% Triton X-100。用新鲜的。
DAPI 解决方案
10 μ g /mL 在 H 2 O中。
TUNEL 检测试剂盒中的 TUNEL 反应混合物
10 μL Reaction Buffer 、 0.75 μL TdT Enzyme 、 8 μL FITC - dUTP 、 32.25 μL ddH 2 O。
1 M 柠檬酸钠
在 H 2 O 中。可能需要加热。在室温下储存。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院、国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所 (AG) 的校内研究计划的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。该协议是对所使用的协议的改编，Parusel (2006)并且与 Kropp et al. (2021).

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Bae, W., Park, JH, Lee, MH, Park, HW 和 Koo, HS (2020)。秀丽隐杆线虫的 exo-1 和 polq-1 突变抑制了对与 PARG 缺乏相关的 DNA 双链断裂的超敏反应。 FEBS J 287（6）：1101-1115。
Chen, X., Wang, Y., Chen, YZ, Harry, BL, Nakagawa, A., Lee, ES, Guo, H. 和Xue , D. (2016)。秀丽隐杆线虫核膜蛋白 NPP-14对 CED-3 半胱天冬酶定位和激活的调节。 Nat 结构分子生物学23（11）：958-964。
Gervaise , AL 和Arur , S. (2016)。秀丽隐杆线虫种系中活性 ERK 的时空分析。 J Vis Exp ( 117)：54901。
Hinman, AW, Yeh, HY, Roelens , B., Yamaya , K., Woglar , A., Bourbon, HG, Chi, P. 和 Villeneuve, AM (2021)。秀丽隐杆线虫DSB-3 揭示了促进减数分裂双链断裂的蛋白质复合物之间的保守性和差异性。 Proc Natl Acad 美国科学118（33）：e2109306118。
Kropp, PA, Wu, J., Reidy, M., Shrestha, S., Rhodehouse , K., Rogers, P., Sack, MN 和 Golden, A. (2021)。以秀丽隐杆线虫为模型的多发性线粒体功能障碍综合征 1 致病突变诱导的等位基因特异性线粒体应激。公共科学图书馆基因17（8）：e1009771 。
Labat-Moleur , F., Guillermet , C., Lorimier , P., Robert, C., Lantuejoul , S., Brambilla, E. 和Negoescu , A. (1998)。组织切片中的 TUNEL 凋亡细胞检测：关键评估和改进。组织化学杂志细胞化学46（3）：327-334。
大都会，DG 和 Meyer，BJ（2009 年）。凝聚素通过控制染色体结构来调节减数分裂 DNA 断裂分布，从而调节交叉频率。单元格139（1）：73-86。
康涅狄格州帕鲁塞尔(2006)。 URI-1 是秀丽隐杆线虫DNA 稳定性所必需的。发展133（4）：621-629。
Pontier , DB 和Tijsterman , M. (2009)。一个强大的双链断裂修复通路网络控制着秀丽隐杆线虫发育过程中的基因组完整性。电流生物学19（16）：1384-1388。
Qi, S. 和Calvi , BR (2016)。不同的细胞周期修饰在不同的步骤抑制细胞凋亡，而与果蝇的发育信号无关。分子生物学细胞27（12）：1885-1897。