材料和試劑
細胞培養
鋁箔_
封口膜
紙巾或吸水紙巾
pH試紙，pH-Fix 0-14 PT，固定指示劑（ Macherey -Nagel，目錄號：92111）（可選）
12孔培養板（Falcon，目錄號：353043）
帶網格的15厘米組織培養皿（Fisher Scientific， Falcon TM 353025，目錄號：10314601）
15-mL錐形管（Fisher Scientific， Falcon TM 352196，目錄號：11507411）
19 - mm玻璃蓋玻片（ VWR ，目錄號： 631-0156 ）
COS-7 電池（ATCC，目錄號：CRL-1651）
DMEM（Gibco，目錄號：21969-035），4°C 儲存
L-谷氨酰胺（Gibco，目錄號：25030-032），儲存於 4°C
2.5% 胰蛋白酶，不含酚紅（Gibco，目錄號：15090046），4°C 儲存
青黴素-鏈黴素（ LifeTechnologies ，目錄號：15140122），4°C儲存
胎牛血清（FBS）（Gibco，目錄號：10270-106），4°C儲存
PE 緩衝液（參見配方，室溫儲存）

化學品
纖連蛋白，牛血漿（Sigma-Aldrich，目錄號：F1141），在4°C下儲存
16％多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，目錄號：15710），室溫儲存
ProLong Diamond 抗褪色封固劑（Invitrogen，目錄號：P36961），儲存於-20 °C
Hoechst 33342（Thermo Scientific，目錄號：62249），儲存於 4°C
葡聚醣，熒光素，70,000 MW，陰離子，賴氨酸可固定（Invitrogen，目錄號：D1822），儲存在 4 °C，避免直接光照（參見程序 A）
70％硝酸（Sigma-Aldrich，目錄號：225711），室溫儲存
乙醇≥99.8％，（無添加劑，無添加劑）（Sigma-Aldrich，目錄號：51976），室溫儲存
EDTA（Fisher Scientific，目錄號：10289410）
蒸餾水
PBS緩沖片（Fisher Scientific，目錄號：10209252），室溫儲存
PBS 緩衝液（見配方）
PE 緩衝液（見配方）
生長 DMEM 培養基（見食譜）
無血清 DMEM 培養基（見配方）
4% PFA 溶液（見配方）

設備

小金屬鑷子
自製孵化室
血細胞計數器或細胞計數器

軟件

Zeiss LSM 710 共聚焦顯微鏡系統（或任何其他常見的共聚焦系統，如果有）
ImageJ 或斐濟 v2.3.0/1.53m
GraphPad 棱鏡 7

程序

以下程序基於我們用來剖析 CYRI 蛋白作用的實驗條件。一個典型的實驗應包含至少兩個葡聚醣的孵育時間點：15 分鐘和 30 分鐘。每個時間點應在單獨的 12 孔板中完成。每個板應至少包含一個用於加擾控制的蓋玻片，每個 CYRI siRNA 處理的樣品應包含一個蓋玻片（至少兩個獨立的 siRNA）。您可以包括其他條件和對照，例如 EIPA（一種 Na + /H +抑製劑）（Koivusalo等人，2010 年）或 LY294002（一種 PI3-K 抑製劑），具體取決於您的實驗設置。以下協議以一個蓋玻片為例進行了描述，但應根據您的實驗條件適當放大。任何處理細胞播種或基質塗層的步驟都必須在生物組織培養罩內完成。可以在組織培養罩外進行孵育室的構建和葡聚醣攝取測定。

製作孵化室 (圖1A)

此步驟可以在生物組織培養罩之外完成。
使用 15 厘米的組織培養皿，並用鋁箔覆蓋板和蓋子的外表面。
剪下一塊 9 cm × 9 cm 的封口膜，放在盤子底部。
用 70% 乙醇對盤子進行消毒。

圖1 。製作自製的孵化室。
A. 自製的培養室，由15 厘米的組織培養板覆蓋鋁箔製成。紅色虛線表示放置在盤內的封口膜。 B. 在蓋上蓋子之前，將濕紙巾放在培養室的邊緣周圍，以防止塗層蓋玻片脫水。

準備酸處理的玻璃蓋玻片

此步驟必須在化學罩中進行。
將 19 毫米玻璃蓋玻片放入 400 毫升玻璃燒杯中。
小心地將 70% 的硝酸倒入燒杯中，直到所有蓋玻片都被淹沒。
非常輕輕地旋轉燒杯，讓酸與所有蓋玻片接觸。
將蓋玻片放在酸中 30 分鐘。
安全地將酸倒回另一個瓶子（酸可以重複使用），並用蒸餾水（每次 50-100 mL）多次清洗蓋玻片約15 分鐘。
（可選）測試溶液的 pH 值，用 pH 條覆蓋蓋玻片，直到其達到大約 pH 7.0。
將燒杯中的水倒掉，並用 100 mL 的 70–100% 乙醇代替。
用封口膜蓋住燒杯口，以減緩蒸發。將燒杯存放在避免陽光直射的地方。只要乙醇仍然存在，蓋玻片就可以在室溫下安全儲存，但請注意乙醇會隨著時間的推移而蒸發。

用纖連蛋白包被蓋玻片

此步驟必須在生物組織培養罩內進行。
通過噴灑 70% 乙醇並讓它們在組織培養罩內乾燥，對孵化室和鑷子進行消毒。
將 PBS 緩衝液中的纖連蛋白稀釋至最終濃度為 10 μg / mL 。
對於每個蓋玻片，將 40 μL的纖連蛋白-PBS 溶液移液到先前放置在孵化室內的封口膜頂部。由於疏水作用，液體應在封口膜上形成液滴。
使用鑷子拿起酸處理的蓋玻片，通過將其浸入 PBS 中快速洗掉乙醇，然後將蓋玻片輕輕放在孵育室中纖連蛋白液滴的頂部。為您的實驗所需的盡可能多的蓋玻片執行此操作。
為了防止脫水，用水潤濕一些組織，將它們放在孵化室的內邊緣，並確保它們不接觸蓋玻片（圖1B ）。
蓋上蓋子，讓蓋玻片在室溫下孵育 1-2 小時。
使用鑷子將每個蓋玻片轉移到 12 孔組織培養板的孔中，並用 PBS 洗滌 3 次。
通過在每口井中添加 1 mL 含有 10% 血清的 DMEM 來阻止蓋玻片。將它們留在細胞培養箱中（37 °C，5% CO 2 ），直到細胞播種。

將細胞播種到蓋玻片上

此步驟必須在生物組織培養罩內進行。
從 80% 融合的 COS-7 細胞的 10 厘米組織培養板中吸出所有培養基。
用 5 mL 的 PBS 清洗細胞。
加入 300 μL的 0.25% 胰蛋白酶溶液，在細胞培養箱（37 °C，5% CO 2 ）中孵育 5 分鐘。
添加 5 mL 的 10% 血清 DMEM，以淬滅胰蛋白酶。
將細胞懸液轉移到 15 mL Falcon 管中，並以 500 × g離心5 分鐘。
吸出培養基，將細胞顆粒重新懸浮在 5 mL 的 10% 血清 DMEM 中。
使用血細胞計數器或自動細胞計數器對細胞進行計數。
使用以下等式計算每個蓋玻片獲得 50,000 個細胞所需的細胞懸浮液體積：

V= 50,000/A×1000 (μL)
V 是細胞懸液的體積（ μL ）。
A 是細胞懸液中的細胞濃度（細胞/mL）。
對於每個蓋玻片，將 50,000 細胞懸浮液的體積與生長培養基一起增加到 1 mL，然後逐滴添加到蓋玻片中。
37 °C 和 5% CO 2下孵育細胞過夜。

葡聚醣攝取測定

配製葡聚醣溶液：
在組織培養罩內，將 PBS 中的葡聚醣粉末重新懸浮至最終濃度為 10 mg/ mL。通過上下移液確保盡可能多的葡聚醣溶解。
將內容物轉移到 1.5 mL Eppendorf 管中，在台式離心機中以 13,523 × g離心15 分鐘，以除去任何未溶解的葡聚醣。
在不干擾沉澱的情況下，將 50 μL的葡聚醣溶液等分到較小的試管中，並在 -20°C 下儲存。

此步驟可以在組織培養罩外完成。
在化驗當天，在開始化驗前準備好這些：
在冰上冷卻 PBS。
在室溫下解凍葡聚醣，並確保它不受任何光源的影響。
37 °C 水浴中預熱無血清培養基，直到實驗。
準備一個冰盤。
在化學通風櫃中的 PBS 中製備 4% 的多聚甲醛 (PFA) 溶液。

將前一天接種在蓋玻片上的兩個 12 孔板從培養箱中取出，放在冰上。

吸出培養基並用冰冷的 PBS 洗滌細胞 3 次。
在溫暖的無血清培養基中稀釋葡聚醣，最終濃度為 0.2 毫克/毫升。

在每個蓋玻片中加入 1 mL 的葡聚醣溶液，然後將板分別快速轉移回細胞培養箱中 15 分鐘和 30 分鐘。
在各自的孵育時間後，用 1 mL 的冰冷 PBS 清洗每個板 3 次，以停止內吞過程並洗去任何多餘的葡聚醣。
在化學罩中，將 500 μL的 4% PFA 添加到每個蓋玻片中，以在室溫下將細胞固定 15 分鐘。
移出 PFA 並根據您所在機構的規定進行適當處理。用 PBS 清洗蓋玻片 3 次。
PBS 中的 Hoechst 稀釋至 2 μM ，在每個蓋玻片中加入 50 μL該溶液，並在室溫下避光孵育 30 分鐘。
30 分鐘後，用 1 mL 的 PBS 洗去多餘的 Hoechst 三次。
μL的安裝介質安裝蓋玻片，並在室溫下將其置於黑暗中過夜。

圖像採集

對於每個蓋玻片，選擇十個隨機視野進行成像。

根據葡聚醣通道 (488 nm) 調整焦點，並使用蔡司 LSM 710 共聚焦顯微鏡的 40 倍物鏡對單個平面進行成像。有關示例圖像，請參見圖2 。

圖2 。使用 Zeiss 710 LSM、40 ×透鏡顯微鏡系統拍攝的 COS-7 細胞的葡聚醣攝取測定示例圖像，以及示例量化。
對照條件是scramble siRNA，siRNA條件是靶向CYRI-A和CYRI-B的siRNA的組合。可以看出，在孵育 15 分鐘時，對照和 siRNA 處理的條件之間沒有太大差異。但在孵育 30 分鐘後，與 CYRI-A/CYRI-B 雙敲低細胞相比，對照細胞吸收了更多的葡聚醣。量化圖改編自我們的原始出版物 (Le et al ., 2021)，每種顏色代表從一次復制中收集的數據。誤差線 = SD。 Hoechst = 青色，葡聚醣 = 洋紅色。比例尺 = 20 μm 。

蔡司軟件自動導出 . czi文件格式，但 .tiff 圖像也適合分析。

圖像分析

人工分析（圖 3 )
打開. ImageJ/Fiji 中的czi圖像（或 .tiff）。
要分離 dextran 和 Hoechst 通道：圖像 -> 顏色 -> 拆分通道。
將兩個通道都轉換為 8 位：圖像 -> 類型 -> 8 位。
複製葡聚醣通道以分析一個內化的葡聚醣信號，並測量另一個中的選定區域：圖像 -> 複製...
在其中一張葡聚醣圖像中，增加亮度直到單元格的輪廓變得可見：圖像 -> 調整 -> 亮度/對比度...
使用手繪選擇工具勾勒選定區域以進行分析。

轉到編輯 -> 選擇 -> 反轉，然後按退格鍵刪除背景。
要測量選定區域：圖像 -> 調整 -> 閾值 -> 設置為 1, 255。這應該以紅色突出顯示選定區域。
分析 -> 分析粒子 -> 設置大小：0–Infinity，圓度：0.00–1.00，顯示：輪廓，勾選顯示結果，匯總並包含孔 -> 確定。
使用組合鍵將選定區域從第一個葡聚醣圖像轉移到第二個葡聚醣圖像： Macbook上的Shift+Command+E ，然後按退格鍵刪除背景。

要測量內化的葡聚醣： Image -> Adjust -> AutoThreshold -> MaxEntropy ，然後如i中所述分析粒子。
將結果復制並粘貼到 Excel 中以進行進一步的統計分析（在後面的部分中描述）。
對其他圖像重複相同的過程。

圖3 。使用 ImageJ/Fiji 的葡聚醣分析工作流程。
虛線箭頭表示通過按下組合Shift+Command+E將感興趣區域（洋紅色輪廓）從一個圖像轉移到另一個圖像。

使用 ImageJ/Fiji 的半自動分析管道：
本節提供完整的宏來自動執行上述大部分步驟，並且與手動分析相比，可以將處理速度顯著提高至少 100 倍。這些宏腳本已經過測試，並成功用於我們的分析。
在運行這些宏之前，請確保設置您的“分析粒子”窗口，如手動分析部分的步驟 1i 中所述。

第 1 步：自動分割兩個通道、調整亮度並將生成的圖像保存到所選文件夾的宏。

在運行宏之前，將所有原始圖像放在任意名稱的文件夾中。這是您的源目錄所在的位置。

在源目錄之外創建第二個任意名稱的文件夾。這是您生成的圖像將保存到（輸出目錄）的位置。

打開一個新的宏窗口：插件 -> 新建 -> 宏
將此宏腳本複制並粘貼到新的宏窗口中。

前面帶“//”的橙色表示註釋，運行時不會包含在代碼中。
如果您想知道每個步驟的作用，只需在隨後的所有步驟前添加雙破折號“//”，將它們從管道中排除，或者只需複制並粘貼其中一個命令行進入一個新的宏窗口，然後單擊運行。

//選擇存儲原始圖像的文件夾（源目錄）。
selectedFolder = getDirectory ( "選擇源目錄");

// getFileList函數返回selectedFolder中存在的所有文件名的數組。
fileList = getFileList ( selectedFolder );

// lengthOf函數計算fileList數組中的文件數（通過擴展，它位於源目錄中）。
numFiles = lengthOf ( fileList );

//選擇要保存導出圖像的文件夾。
saveloc = getDirectory ( "選擇輸出目錄");

//這是可選的，但您可以打印出源目錄文件夾中的文件數量，作為檢查代碼是否正常工作的一種方式。將彈出一個窗口，顯示文件的數量。
打印（數字文件）

// BatchMode自動關閉任何打開的圖像窗口以避免混亂。您也可以將其關閉。
設置批處理模式（真）；

//下面的整個塊是一個迭代命令，它將遍歷源目錄中的每個文件，將圖像轉換為 8 位，調整它們的亮度，並將它們保存在您選擇的文件夾中。
對於 ( i = 0;i < numFiles;i ++) {
文件=文件列表[我] ；
打開（選定文件夾+文件）；
//確保在下一個命令之前在 Bio-Formats Import Option 彈出窗口中取消選中多通道圖像的 Split Channels 選項。然後，按 Enter 繼續。
運行（ “拆分頻道”）；
選擇窗口（ “C2-”+文件）；
運行（“8位”）；
運行（“8位”）；
重命名（ “1”）； //將圖像重命名為稍後更容易選擇的窗口
運行（ “重複...”，“”）；
選擇窗口（ “1-1”）；
run( "亮度/對比度...");
setMinAndMax ( 0, 20);
//保存帶有前綴“Area_”或“Dextran_”的圖像，附加到原始文件名。
saveAs （ “Tiff”， saveloc +“Area_”+文件）；
選擇窗口（ “1”）；
saveAs ( "Tiff", saveloc + "Dextran_" + 文件);
運行（ “關閉所有”）；
}

第2步：
這是唯一的手動步驟。
現在所有處理過的圖像都保存到輸出文件夾中，打開名稱中帶有“Area_”前綴的圖像，在手動分析部分重複步驟 1f 和 1g，然後使用步驟 1j 從“ Area_”圖像到名稱中帶有“Dextran_”前綴的圖像。
將新處理的圖像分別保存到名為“Area”和“Dextran”的新文件夾中。
如果包括鬼筆環肽染色，可以自動分割細胞，這一步可以自動化。

第 3 步：
用於測量所選區域面積的宏。
將此宏複製並粘貼到新的宏窗口中，然後單擊運行。
當這個宏完成運行時，包含測量結果的結果文件將保存到選定的輸出目錄中。

//選擇“區域”文件夾作為您的源目錄。
selectedFolder = getDirectory ( "選擇源目錄");

fileList = getFileList ( selectedFolder );

numFiles = lengthOf ( fileList );

//選擇與輸出目錄相同的“區域”文件夾。
Saveloc = getDirectory ( "選擇輸出目錄");

設置批處理模式（真）；

//下面這整個塊是一個迭代命令，它將遍歷源目錄中的每個文件，測量所選區域的面積，並將結果導出為 csv。文件到“區域”文件。
對於 ( i = 0;i < numFiles;i ++) {
文件=文件列表[我] ； //將文件從 0 索引到i 。
打開（選定文件夾+文件）；
setAutoThreshold ( "默認暗");
運行（ “閾值...”）；
設置閾值( 1, 250);
run( "分析粒子...", "show=Outlines 顯示總結");
選擇窗口（“結果”）； //這會選擇結果窗口
//這會將結果文件保存到名為“Area”的文件夾中
saveAs （ “結果”，“/Users/ale/Desktop/Area/Results.csv”）；
運行（ “關閉所有”）；
}

第四步：
用於測量內化葡聚醣的宏。
將此宏複製並粘貼到新的宏窗口中，然後單擊運行。
當這個宏完成運行時，包含測量結果的摘要文件將保存到選定的輸出目錄中。

//選擇“Dextran”文件夾作為您的源目錄。
selectedFolder = getDirectory ( "選擇源目錄");

fileList = getFileList ( selectedFolder );

numFiles = lengthOf ( fileList );

//選擇與輸出目錄相同的“Dextran”文件夾。
saveloc = getDirectory ( "選擇輸出目錄");

設置批處理模式（真）；

//下面的整個塊是一個迭代命令，它將遍歷源目錄中的每個文件，測量內化的葡聚醣信號，並將摘要文件導出為 csv。文件到葡聚醣文件夾。
對於 ( i = 0;i < numFiles;i ++) {
文件=文件列表[我] ；
打開（選定文件夾+文件）；
//應用最大熵圖像的自動閾值
//您可以使用除 MaxEntropy 之外的其他AutoThreshold ，具體取決於您的圖像採集。
運行（ “自動閾值”，“方法=最大熵白色”）；
運行（ “閾值...”）；
設置閾值（ 255、255）；
run( "分析粒子...", "show=Outlines 顯示總結");
運行（ “關閉所有”）；
}
選擇窗口（“摘要”）；
saveAs （ “結果”，“/Users/ale/Desktop/Dextran/Summary.csv”）；
//最後兩個命令在“for”循環之外，以允許將所有摘要結果放入同一個窗口，從而一次保存所有結果。

數據分析

一旦你分析了所有圖像並獲得感興趣區域的面積，以及葡聚醣信號的面積，我們可以使用公式計算內化指數：

Internalisation index= (Dextran signal)/(Area of region of interest)

使用適當的軟件（例如Graphpad Prism ）繪製內化指數。在分析之前進行至少三個獨立的生物學重複（單獨的實驗在三天內至少重複三次）。您還可以根據您的假設和實驗設計，在每個生物複製中包含每個測試條件的技術複製。
如果在兩組之間進行比較，檢查它們的分佈是否為正態分佈，然後應用雙尾雙樣本非配對 t 檢驗。
我們的分析描述可以在統計分析部分找到，以及我們原始手稿中圖 5 的圖例( Le et al. , 2021 ) 。

如需測試宏，請訪問 Anh Hoang Le's Github頁面： https ://github.com/AnhLe2702/20211019_MacroImageJ_Automatic_split_export_images並下載兩個測試圖像文件，分別標記為 scr_30_6.czi 和 36_30_6.czi。

食譜

PBS緩衝液
1 L PBS 在 1 L 蒸餾水中含有 10 片 PBS。

PE緩衝液
5 L PBS 緩衝液，1.86 g EDTA。

生長 DMEM 培養基
500 mL DMEM、50 mL血清、5 mL L-谷氨酰胺、5 mL青黴素-鏈黴素。

無血清 DMEM 培養基
500 mL DMEM、5 mL L-谷氨酰胺、5 mL 青黴素-鏈黴素。

4% PFA 溶液
10 毫升 16% PFA
30 毫升 PBS

致謝

我們感謝英國癌症研究中心的核心資金（A17196 和 A31287）以及對 LM Machesky的資金（A24452）。
濕實驗室程序的靈感來自Commisso 等人。 (2014) 和 Anh H. Le等人。（2021 年）。

Le, AH, Yelland, T., Paul, NR, Fort, L., Nikolaou, S., Ismail, S. 和 Machesky, LM (2021)。 CYRI-A 通過大胞質體形成和整合素攝取調節來限制侵入性遷移。細胞生物學雜誌220(9)。

競爭利益_

作者聲明沒有競爭利益。

參考

Bloomfield, G. 和 Kay, RR (2016)。巨胞飲作用的使用和濫用。細胞科學雜誌 129（14）：2697-2705。
Commisso, C.、Flinn, RJ 和 Bar-Sagi, D. (2014)。通過基於圖像的定量測定確定細胞的巨胞飲指數。國家協議9（1）：182-192。
Davidson, AJ 和 Insall, RH (2011)。基於肌動蛋白的動力：WAVE 監管複雜結構重新打開了舊的 SCAR。 Curr Biol 21（2）：R66-68。
Goley, ED 和 Welch, MD (2006)。 ARP2/3 複合物：肌動蛋白成核劑成熟。 Nat Rev Mol Cell Biol 7（10）：713-726。
Koivusalo, M.、Welch, C.、Hayashi, H.、Scott, CC、Kim, M.、Alexander, T.、Touret, N.、Hahn, KM 和 Grinstein, S. (2010)。 Amiloride 通過降低膜下 pH 值和阻止 Rac1 和 Cdc42 信號傳導來抑制巨胞飲作用。細胞生物學雜誌 188（4）：547-563。
Krause, M. 和 Gautreau, A. (2014)。引導細胞遷移：lamellipodium 動力學和定向持久性的調節。 Nat Rev Mol 細胞生物學15（9）：577-590。
Le, AH, Yelland, T., Paul, NR, Fort, L., Nikolaou, S., Ismail, S. 和 Machesky, LM (2021)。 CYRI-A 通過大胞質體形成和整合素攝取調節來限制侵入性遷移。細胞生物學雜誌220（9）： e202012114。
Machacek, M.、Hodgson, L.、Welch, C.、Elliott, H.、Pertz, O.、Nalbant, P.、Abell, A.、Johnson, GL、Hahn, KM 和 Danuser, G. (2009) .細胞突起過程中 Rho GTPase 活性的協調。自然461（7260）：99-103。
Schindelin, J.、Arganda-Carreras, I.、Frise, E.、Kaynig, V.、Longair, M.、Pietzsch, T.、Preibisch, S.、Rueden, C.、Saalfeld, S.、Schmid, B ., et al ., A. (2012)。斐濟：一個用於生物圖像分析的開源平台。 Nat 方法9（7）：676-682。
Swanson, JA 和 Watts, C. (1995)。巨胞飲作用。趨勢細胞生物學5（11）：424-428。
Theveneau, E. 和 Mayor, R. (2013)。上皮和間充質細胞的集體細胞遷移。細胞分子生命科學70（19）：3481-3492。