材料和试剂
1. 225 毫升烧瓶
2. 搅拌棒
3. 100毫米方形培养板（Midwest Science，目录号： PD115）
4. 滤纸（Whatman，目录号：WHA1001055）
5. Seal-Rite 1.5 mL 微量离心管，天然，无菌（USA Sci，目录号：1615-5510）
6. 2 mL微量离心管（USA Scientific，目录号： NC9558509）
7. 4.5 毫米钢珠（Daisy 40 BBS，4000 CT，0.177 口径，镀锌钢，4.5 毫米）
8. 微孔胶带（3M，Fisher Scientific，目录号：19-061-655）
9. Iminobilon -FL PVDF 膜（Merck Millipore Ltd.，目录号： IPFL00010）
10. 3M封闭纸（Fisher Scientific，目录号： 05-716-3T）
11. 拟南芥种子（Col-0 背景，ABRC）
12. Linsmaier和 Skoog（LS）基础盐（Caisson Labs，目录号：LSP04-1LT）
13. 琼脂（Fisher BioReagents ，800-199 Mesh，目录号：BP26411），
14. 尸胺二盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：22330-10F）
15. 生物素（Sigma-Aldrich，目录号：B4639）
16. 95％乙醇（ Pharmco ，目录号：111000190）
17. 液氮
18. Pierce BCA 蛋白测定试剂盒（Thermo Scientific，目录号：23225）
19. NuPAGE LSD 样品缓冲液（4 × ）（Invitrogen，目录号：NP0007）
20. NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel，1.0 mm，10 孔（Invitrogen，目录号： NP0321BOX）
21. NuPAGE MOPS SDS BUFFER 20 × ，500 mL（Invitrogen，目录号： NP0001）
22. 颜色预染蛋白质标准品，宽范围（11-245 kDa ）（New England Biolabs，目录号：P7719）
23. NuPAGE 转移缓冲液（1 L）（Invitrogen，目录号： NP0006）
24. NuPage 抗氧化剂（Invitrogen，目录号： NP0005）
25. 封闭缓冲液（LI-COR，目录号： 927-600001）
26. BCCP1 抗体（由俄亥俄州植物抗体设施Basil Nikolau实验室生成）
27. 俄亥俄州植物抗体设施Basil Nikolau实验室生成）
28. RPT4A 抗体（由威斯康星大学麦迪逊分校的 Richard Vierstra实验室提供，现为华盛顿大学，圣路易斯，MO）
29. IRDye 800CW 链霉亲和素（VWR，目录号： 102673-342）
30. 蛋白质提取缓冲液（见配方）
31. 20 × TBS 溶液（见配方）
32. TBST（见食谱）
33. 链霉亲和素染料溶液（见食谱）

设备

1. 植物生长室（ Conviron TC30 或同等产品）
2. Milli-Q 水系统 ( MilliQ Plus PF)
3. 搅拌板（Fisher Scientific）
4. 烤箱（Lab Line，型号：403）
5. 具有 300+ DPI 分辨率的文档扫描仪（Epson Perfection，型号：V33）
6. 混合机（ Reisch ，型号：MM200）
7. X-cell SureLock Mini-Cell 电泳系统（Invitrogen，型号：EI0001）
8. 电源模块（ BioRad ，型号：200/2.0）
9. 电泳电源（ Amersham Pharmacia Biotech，型号：EPS 601）
10. 离心机（Eppendorf，型号：5424）
11. 高压釜（AMSCO，型号：3021-S）
12. 摇床/旋转器（ Bellco Biotech，型号：7744-01010）
13. 成像系统（LI-COR Odyssey）

软件

1. ImageJ（美国国立卫生研究院， https://imagej.nih.gov/ij/download.html ）
2. 图像工作室（LI-COR， https://www.licor.com/bio/image-studio/ ）

程序

A. 幼苗生长培养基的制备

1. 为所需数量的植物生长培养基准备 Milli-Q 水，并将其分配到带有搅拌棒的大烧杯中：每盘需要 35 mL 的培养基。
2. 将装有水的烧杯放在搅拌板上，边搅拌边加入 LS 包，生成 0.5 × LS 介质溶液。让 LS 完全溶解。
3. 准备 1 个装满 500 mL LS 液体介质的 L-screwcap 瓶。
4. 称重 7.5 克琼脂并放入每个瓶子中，制成 1.5% 的琼脂培养基。
5. 将搅拌棒放入每个瓶子中，并将琼脂与 LS 溶液混合。
6. 拧紧盖子，在液体循环中高压灭菌 30 分钟。
7. 灭菌后，将培养基瓶放入 65°C 烤箱中，直到培养基冷却到足以处理。
8. 从水中制备的 1 M 尸胺储备溶液中添加浓度范围为 2 µ M 至 2 mM 的尸胺（见注释）。生物素也可以从 1 mM 的水中添加至 1 µ M（见注释）。
9. 将 35 mL 的介质倒入层流罩中的 100 mm 方形培养板中。盘子冷却后，盖上盖子，用塑料包裹。将盘子在冷藏室中存放长达一个月。

B. 电镀拟南芥种子

1. 使用 95% 乙醇对实验室工作台或层流罩进行消毒。
2. 将所需数量的种子等分到 1.5 mL 离心管中，加入 1 mL 的 95% 乙醇，然后在乙醇中涡旋种子 1 分钟。
3. 将种子和乙醇移到一张滤纸上，让它们完全干燥。
4. 种子和滤纸干燥后，使用无菌牙签或移液器尖端，将 12 颗种子放在琼脂表面，沿直线排列，距离板顶部 1 厘米。
5. 将板包裹在微孔胶带中。
6. 将盘子放在遮光箱中，或用铝箔覆盖它们，以阻挡所有光线。
7. 将盘子在 4 °C 下放置 3 天。

C. 种植拟南芥种子

1. 3天冷处理程序后：将板置于生长室中，温度为22 °C，相对湿度为65%，经受60 μmol /m 2 /s冷白光照射，16 h -白天/8小时-夜间循环。
2. 从冷盘中取出盘子，打开包装并将它们放在植物生长室中，垂直或与垂直方向成 30 °角向后倾斜，以刺激根部挥动(Rutherford and Masson, 1996)。
3. 要分析尸胺和/或生物素处理后的根系生长情况，请每天使用文件扫描仪以 300 dpi 或更高的分辨率扫描板。
4. 使用 ImageJ 中的分段线函数测量根生长。

D. 生物素化定量的拟南芥组织的制备

1. 如上所述的平板幼苗。
2. 在所需的生长期（我们在将分层种子放入生长室后 8 天使用）后，解剖幼苗或收获整株幼苗，并将样品放入带有一个 4.5 毫米钢珠的 2 mL 微离心管中。立即在液氮中冷冻。大约需要 200 毫克的组织。
3. 将组织研磨成粉末。快速将冷冻管放入Mixmill并以每秒 25 次的速度均质化 45 秒。放回液氮中，然后将样品重新加载到Mixmill中，再重复一次。
4. 将试管从液氮中取出并放在冰上，让试管轻轻解冻。
5. 添加蛋白质提取缓冲液（以微升为单位的体积等于以微克为单位的组织量的四倍，例如，对于 200 mg 组织，添加 800 µL 蛋白质提取缓冲液）。轻轻混合。
6. °C下轻轻搅拌（例如通过旋转）匀浆管30 分钟。
7. 以最高速度和 4 °C将匀浆离心30 分钟。
8. 取出上清液并将试管置于冰上。
9. 使用 Pierce BCA 蛋白质检测试剂盒，按照制造商的说明确定每个样品中的蛋白质含量。
10. 标准化蛋白质，使每个蛋白质样品的浓度相同，根据需要使用蛋白质提取缓冲液稀释样品。
11. × LSD 样品缓冲液为 SDS 页准备蛋白质匀浆。
12. 将样品在 65 – 70°C 下加热15 分钟，使蛋白质线性化。此时，如果需要，可以将样品冷冻在 -20 °C 。

E. 用链霉亲和素检测生物素化蛋白

1. 准备蛋白质凝胶。我们使用 Invitrogen X 细胞锁定系统。通过从库存中稀释来制备 500 mL 的 MOPS-SDS 运行缓冲液。将 200 mL 分离到烧瓶中并添加抗氧化剂。
2. 设置凝胶运行箱并添加搅拌棒。如果只运行一种凝胶，请使用填充板。
3. 打开凝胶的包装并去除底部的白色胶带。
4. 将蛋白质凝胶添加到盒子中并将其固定到位。在内孔中加入 200 mL 含有抗氧化剂的运行缓冲液，其余 300 mL 到外孔中。
5. 小心取出凝胶梳。
6. 使用移液器，用运行缓冲液轻轻冲洗孔。
7. 加载凝胶，确保在其中一个井中加入 4 μL的蛋白质标准。
8. 盖上盖子，在冰上以 50 V 运行凝胶。一旦染料前沿通过了堆叠阶段，电压可以增加到 100 V。
9. 在凝胶运行时，准备转移缓冲液。在 225 mL 烧瓶中，添加 12.5 mL 的NuPAGE转移缓冲液。用 ddH 2 O填充至 225 mL 。加入 20 – 25 mL 甲醇和抗氧化剂，并混合。
10. 在烧瓶中装满 500 – 600 mL 的冷水，用于外室。盖上烧瓶并将其置于 4 °C直至凝胶完成。
11. 通过将一张膜纸和两张 3M 纸切成 8.9 x 5.7 厘米的矩形来准备膜和封闭纸。使用铅笔，可以在角落标记膜。
12. 在凝胶完成运行前至少 30 分钟（当凝胶前端到达底部的 75% 时），用甲醇覆盖膜以激活 PVDF 膜。
13. 凝胶完成后，使用抹刀将凝胶的塑料盒破裂。用手术刀小心地切掉凝胶上的染料前部和梳子。
14. 将凝胶置于转移缓冲溶液中。
15. 洗掉凝胶盒。
16. 准备海绵。不要过度包装海绵，因为它会损坏转移装置。使用一个大盘子，将转移缓冲液倒在海绵上以润湿海绵，确保它们浸泡在转移缓冲液中。从海绵中挤出多余的空气。
17. 将一张 3M 纸弄湿并放在 2-3 块海绵上。将凝胶放在 3M 封闭纸上，蛋白质标记在右侧。
18. 将膜放在凝胶顶部，标签面朝下，去除任何气泡。
19. 添加另一张浸泡过的 3M 阻隔纸和剩余的湿海绵。
20. 关闭转印盒并放入凝胶盒中。添加剩余的转移缓冲液，直到腔室被填充到顶部。
21. 用冷水填充外腔。
22. 在 15 V、160 mA、3 W、冰上过夜（16 小时）运行转移。
23. 用封闭缓冲液封闭膜，4 ° C 1 h。
24. 用 TBST 缓冲液清洗膜 3 次，每次 5 分钟。
25. 将膜孵育到链霉亲和素染料溶液（参见食谱）1 小时。
26. 用 TBST 清洗膜 3次7分钟。
27. 在黑暗中干燥膜（例如用铝箔覆盖），并在 LI-COR Odyssey 成像系统中使用Image Studio 软件对其进行成像。生物素化蛋白质及其分子量列于表 1。

表 1. 链霉亲和素检测到的生物素化蛋白。

主要生物素化蛋白质尺寸角色本土化
MCCA 80 kDa 亮氨酸降解线粒体
BCCP1 35 kDa 脂肪生成质体
BCCP2 25 kDa 脂肪生成质体

拟南芥中生物素化蛋白的实验方案。
为了分析拟南芥蛋白质的生物素化，幼苗在蛋白质提取缓冲液中均质化并通过 SDS 页分离。转移到膜上后，用链霉亲和素染料探测膜，这样可以观察膜上的生物素化蛋白质。可以量化膜上每个条带的信号强度，以确定相应样品中生物素化蛋白的水平。

数据分析

A. 幼苗根系生长分析

1. 根系生长量化后，在 Excel 中对所有样本进行类似处理。
2. 计算平均值和标准误差，并绘制结果。
3. 要确定两个治疗组之间是否存在统计学上的显着差异，请执行学生的 t检验，使用 0.05 的 p 值作为显着性阈值（学生，1908 年）。如果有两个以上的样本，则需要进行 ANOVA 测试。

B. 蛋白质生物素化分析

1. 在三个独立的生物复制之后，可以对生物素化的蛋白质进行统计分析。
2. 使用 Image Studio 软件，测量每个波段的光密度。
3. 执行学生的 t检验以确定处理和对照处理样品的三个生物学重复之间是否存在统计差异。
4. 为了解决由于凝胶上样错误导致的蛋白质含量差异，我们建议使用标准蛋白质印迹实验方案并使用可用作上样对照的抗体进行检测。我们使用蛋白酶体蛋白 RPT4A (45 kDa ) 的抗体，但微管蛋白 α 链 (50 kDa ) 也可用作上样对照。
5. 为了确定对载脂蛋白的影响，应使用针对 MCCA、BCCP1 或 BCCP2 蛋白的特异性抗体进行标准蛋白质印迹分析。应比较生物素化和载脂蛋白的变化，以确定信号变化是否与蛋白质数量的变化与生物素化水平的变化有关。

笔记

1. 生物素溶液在使用前应进行高压灭菌(Schneider et al., 1989)。未经高压灭菌，生物素不溶于溶液，并可能导致培养基污染。
2. 不应重复使用用于探测膜的链霉亲和素染料溶液。在我们手中，如果重复使用，信号就会耗尽，无论是由于失去稳定性，还是由于溶液被产生生物素的微生物污染，这可能会淬灭信号。
3. 加载控制蛋白，以确保尸胺处理不会改变其表达。
4. 蛋白质提取缓冲液应新鲜配制。
5. 上样对照蛋白应具有与生物素化蛋白不同的分子量。
6. 代替封闭缓冲液，TBST 中的 1% 脱脂牛奶(Sigma M7409)可用于溶解链霉亲和素染料。
7. 尸胺原液应储存在 4 ° C。我们已使用具有相似结果的原液长达一年。

食谱

1. 蛋白质提取缓冲液

库存解决方案数量/金额最终浓度
MOPS/NaOH，pH 7.5 0.04184 g 在 9.3 mL 的 ddH 2 O中 20毫米
氯化镁2 0.0475 克 5毫米
氯化钾 0.03728 克 5毫米
蔗糖 0.171 克 50毫米
0.1 M数字地面电视 100 微升_ 1毫米
罗氏抑制剂鸡尾酒 1 片
甘油 0.7 毫升 7%
ddH 2 O中总计 10 mL

2. 20 × TBS 溶液

库存解决方案数量 20 ×浓度
氯化钠 163.63 克 2.8 万
氯化钾 4.473 克 60毫米
三碱基 60.57 克 0.5M
ddH 2 O中的总 1 L

3. TBST溶液

库存解决方案体积浓度
20 × TBS 25 毫升 1 ×
吐温-20 5 毫升 1%
添加多达 500 mL 的 ddH 2 O

4. 链霉亲和素染料溶液

库存解决方案数量/金额浓度
阻塞缓冲区 50 毫升 1 ×
链霉亲和素染料 25微升_ 25微克_
总共 50 毫升

致谢

这项工作得到了农业和生命科学学院的 HATCH 奖 #WIS10338、威斯康星大学麦迪逊分校研究和研究生教育副校长办公室的秋季竞赛奖 #MSN226688 和美国国家航空航天局的资助 # 80NSSC19K1483的支持。空间管理局。该协议源自 Gibbs等人。（2021 年）。检测生物素化蛋白的方案改编自 Li等人。（2012）。

利益争夺

作者没有要声明的竞争利益。

参考

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Gibbs, NM, Su , SH, Lopez-Nieves, S., Mann, S., Alban, C., Maeda, HA 和 Masson, PH (2021)。尸胺调节生物素合成以调节拟南芥的初生根生长。植物 J 107（5）：1283-1298。
Guan, X., Diez, T., Prasad, TK, Nikolau , BJ 和 Wurtele, ES (1999)。香叶酰辅酶A羧化酶：植物中一种新型的含生物素的酶。拱生化生物物理学362（1）：12-21。
Jancewicz , AL, Gibbs, NM 和 Masson, PH (2016)。尸胺在植物发育和环境反应中的功能作用。前沿植物科学 7 ：870。
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Rutherford, R. 和 Masson, PH (1996)。拟南芥sku 突变体幼苗在根生长载体中表现出夸大的表面依赖性改变。植物生理学111（4）：987-998。
Schneider, T.、Dinkins, R.、Robinson, K.、 Shellhammer , J. 和Meinke , DW (1989)。拟南芥胚胎致死突变体是一种生物素营养缺陷型。开发生物学131（1）：161-167。
Strohm ，AK，Vaughn，LM 和 Masson，PH（2015 年）。 ORGANIC CATION TRANSPORTER 1 表达的自然变化影响拟南芥根长度对尸胺的反应。 J Exp Bot 66（3）：853-862。
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Wurtele, ES 和 Nikolau, BJ (1990)。植物含有多种生物素酶：在植物界发现了 3-甲基巴豆酰-CoA 羧化酶、丙酰-CoA羧化酶和丙酮酸羧化酶。拱生化生物物理学278（1）：179-186。