材料和试剂

A. 耗材和试剂
1. 锥形离心管，50 mL（ Thermo Fisher Scientific，目录号：14-432-22）
2. 锥形离心管，15 mL（ Thermo Fisher Scientific，目录号：14-959-53A）
3. 圆底聚苯乙烯管，5 mL（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-959-1A）
4. 微量离心管； 0.5、1.5和 2 mL（ Tarsons ，目录号：分别为 500000、500010 和 500020）
5. PCR板（ Bio-Rad Laboratories，目录号：HSP9601 ）
6. RPMI 1640培养基（ HiMedi a Laboratories，目录号：AL162S）
7. 胎牛血清（FBS，热灭活）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10082147）
8. 青霉素 G（Sigma-Aldrich，目录号：P3032）
9. L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G8540）
10. 链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：S9137）
11. EasySep Human CD4 + T 细胞分离试剂盒（ Stemcell Technologies Inc.，目录号：19052 ）
12. 佛波12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）（Sigma-Aldrich，目录号：P1585）
13. 离子霉素（Sigma-Aldrich，目录号：I0634）
14. SuperScript III Platinum One-Step qRT -PCR Kit（ Invitrogen ，目录号：11732020）
15. My Taq TM DNA聚合酶（ Bioline ，目录号：BIO-21105）
16. PCR密封剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：MSB1001）
17. FITC 小鼠抗人 CD4 抗体（ BD Biosciences，目录号：566802）
18. FITC 小鼠 IgG1，ĸ 同型对照（ BD Biosciences，目录号：349041）
19. APC 小鼠抗人 CD3 抗体 ( BD Biosciences, 目录号：555342）
20. APC 小鼠 IgG2a，ĸ 同型对照（ BD Biosciences，目录号：550882）
21. Live/Dead Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit，用于 633 或 635 nm 激发（Thermo Fisher Scientific，目录号：L10120）
22. 外周血单个核细胞 (PBMC)
23. 复兴媒体（见食谱）
24. 富集培养基（见食谱）
25. 染色缓冲液（见配方）
26. 补充有 10% FBS 的 RPMI 培养基（见配方）
27. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液（见食谱）
28. Tris-EDTA (TE) 缓冲液（参见配方）
29. 40 µg/mL PMA （见配方）
30. 4 µg/mL 离子霉素（见配方）

B. 引物和探针（表 1）

表格1。 PCR 和 cDNA 合成中使用的引物和探针的详细信息
O寡核苷酸身份_ 坐标_ (HXB2) 序列（5'-3' ）

引物 N2830 (OFP) 514-540 CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCT
N2831 (ORP) 8510-8539 CTCAATCGGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG
N2832 (IFP) 577-603 GACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGA
N2833 (IRP) 8419-8448 TGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTTCGATTC
探测 N2842 683-709 (FAM)-CTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGA-(BHQ-1)
逆转录引物 N4101 9031-9046 TTTTTTTTTTTTTCAGAGCACTC
N4102 9032-9046 TTTTTTTTTTTTTCAGAGCACTCAAG
N4103 9033-9046 TTTTTTTTTTTTTCAGAGCACTCAAGG
笔记：
a. OFP 和 ORP：外部正向和反向引物，IFP 和 IRP：内部正向和反向引物，RT 引物：逆转录引物。
b. 反向引物序列以反向补体形式呈现。
c. 引物由 Sigma-Aldrich 合成。

设备

1. 液氮容器（IOCL Cryocan ）
2. 4°C冰箱（三星）
3. –80°C 冰箱（Thermo Scientific）
4. CO 2培养箱 ( NuAire )
5. 水浴（BS 企业）
6. CFX96 Touch 实时 PCR 检测系统（Bio-Rad 实验室）
7. 层流罩（NV -Equipes ）
8. 倒置显微镜 (Leica DM IRB)
9. 流式细胞仪（BD FACSAria TM III）
10. ( TECH- LABCARE )

软件

1. FCS 6 Express TM流式细胞仪（De Novo TM软件）
2. GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.)
3. 极限稀释分析 (ELDA)（Walter + Eliza Hall 生物信息学，医学研究所）。一个免费的网络工具可在 https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/

程序

A. PBMC的复兴
1. 从液氮容器中取出所需数量的含有储存的 PBMC 的小瓶，并立即使用水浴在 37°C 下解冻细胞。
笔记：
a. 至少 2 × 10 6 – 3 × 单次检测需要10 6 个富集的CD4 + T 细胞（见下文）。
b. 健康人的 CD4 百分比通常为总淋巴细胞的 30 %至40%，但在未接受过抗逆转录病毒治疗的 HIV-1 感染者中，这一比例可能会显着降低。因此，单次检测可能需要 30 × 10 6 – 50 × 10 6存储的 PBMC。
c. 此外，可能有必要考虑可能导致细胞损失的其他实验参数。例如，细胞储存、复活和激活可能会导致一小部分细胞死亡。同样，流式细胞术验证可能需要留出一小部分细胞（参见下面的步骤 4）。
d. 处理感染 HIV 的细胞时，必须采取以下基本预防措施：
i. 所有实验必须在生物安全 3 级实验室 (BSL-3) 或“BSL-2 Plus”实验室 (BSL-2+) 中进行，即“BSL-3 实验室减负压”。请注意，常规 BSL-2 不适用于 HIV-1 工作。
ii. 研究人员必须严格遵守 BSL-3 设施规定的所有安全程序。
iii. 有关操作程序的更多信息，请参阅以下参考资料(Duane, 2013) 。
2. 在培养罩中，将 PBMC 汇集在 15 mL 或 50 mL 塑料管中，该塑料管在室温下含有复兴培养基（以 1:3 的比例混合样品和复兴培养基体积）。
注意：在解冻 PBMC 之前，将所需体积的复兴培养基分配到培养罩中随时可用的塑料管中。
3. 使用血细胞计数器确定细胞计数。
4. 留出 0.3 × 10 6 PBMC 的等分试样，用于流式细胞术分析。
笔记：
a. 这些单元格将代表“预浓缩”样本。稍后将在 CD4 + T 细胞富集之后收集类似的样本（参见下面的步骤 9），标记为“富集后”样本。通过流式细胞术比较这两个样品将确定 CD4 + T 细胞的倍数富集（参见下面的程序 C）。
b. 此外，这些细胞还将用于解释流式细胞术的两个额外控制，包括“无染色”和“同型”控制。

B. + T 细胞的富集
5. 以 750 × g离心含有 PBMC 池的塑料管和室温10分钟。倒出上清液，轻轻松开细胞沉淀。
6. 在室温下将约 50 × 10 6 PBMC 的颗粒重新悬浮在 1 mL 的浓缩培养基中，并将细胞转移到 5 mL圆底聚苯乙烯管中。
7. 使用EasySep Human CD4 T 细胞分离试剂盒从 PBMC中富集 CD4 + T 细胞。
8. 在室温下，将富集的 CD4 + T 细胞收集在新鲜的 15 mL 塑料管中，该塑料管中含有 2 mL 的RPMI 培养基，辅以 10% FBS。
9. 确定细胞计数并保留 0.1 × 10 6 个细胞的等分试样，用于流式细胞术分析。
笔记：
a. 将试管标记为“富集后”样品。
b. 大约，在这个阶段预计会有2 × 10 6 – 3 × 10 6富集的 CD4 + T 细胞，尤其是来自临床样本。
10. 旋转其余的细胞并将细胞颗粒重新悬浮在 2.0 mL 的完整 RPMI 培养基中。将 950 µL 细胞悬液分装到 24 孔簇板的两个孔中，并在 37°C 下孵育3-5小时。将水井标记为“无激活”和“激活”。两个细胞群中的一个将被激活，而另一个将作为 U-TILDA 中的“无激活”控制。
注意：孵育将使细胞在复活后恢复。

C. 通过流式细胞术验证 CD4 + T 细胞富集
在细胞富集过程之前和之后，上面保存了两个不同的样本（步骤 4 和 9）。除非另有说明，以下所有步骤均在室温下进行。
11. 用步骤 4 和 9 中的细胞在 750 × g下将试管离心5 分钟。吸出培养基，松开细胞沉淀，将细胞重悬于 1 mL 的 PBS 中（PBS 应在室温下），并在 750 下离心 × 克 5分钟。
12. 吸出上清液，松开细胞颗粒，并将细胞重新悬浮在 100 μL 的 PBS 中（PBS 应在室温下）。
13. 通过将 30 μL 的细胞悬浮液转移到每个小瓶中，将“预浓缩”细胞分成三个小瓶。将小瓶标记为“无染色”对照、“同型”对照和“预浓缩”样品。在每个小瓶中加入60 μL的 PBS，使总体积为90 μL 。同样，将“富集后”样品的所有细胞暂停在 90 μL 的 PBS 中。
注意：两个对照瓶对于富集前和富集后的样品是通用的。
14. 将小鼠抗人 CD4 抗体-FITC 偶联物和小鼠抗人 CD3 抗体-APC 偶联物各 5 μL 添加到“前-”和“富集后”小瓶中。同样，将小鼠 IgG1、κ 同型抗体-FITC 偶联物和小鼠 IgG2a、κ 同型抗体-APC 偶联物各 5 μL 添加到“同型对照”小瓶中。
15. 将样品在 4°C 避光孵育 45 分钟。
16. µL 染色缓冲液以 750 × g离心洗涤细胞两次 5 分钟，吸出染色缓冲液，松开细胞沉淀。
17. 将细胞重新悬浮在100 μL 的染色缓冲液中。
18. 使用流式细胞仪获取样本数据。
注意：理想情况下，应尽快分析染色样品。如有必要，样品可在 4°C下储存 3 – 4 小时。
19. 首先，通过定义 FSC 和 SSC 散射来识别淋巴细胞群，使用“无染色”控制（图 1A ）。然后，使用 CD3-APC 和 CD4-FITC 染色在活细胞群上放置一个象限（图 1B - D ）。使用定义的门，分析其余样本。
笔记：
a. 可能有必要通过在协议中添加活死染色步骤来确定活细胞群。一小部分 PBMC 可能在细胞复活后死亡。活细胞比例必须为 70% 或更高。
b. 在受体染色步骤之前，对细胞进行活-死染色方案。向悬浮在90 µL PBS 中的细胞中加入 10 µL 1000 倍稀释的Live/Dead Fixable Far Red Dead Cell Stain ，并在 4°C 避光孵育小瓶 45 分钟。
c. 孵育后，通过向小瓶中加入 500 μL 染色缓冲液并在 750 × g下将小瓶离心5 分钟来清洗细胞。吸出染色缓冲液并松开细胞沉淀。
d. 将细胞重新悬浮在90 μL 的 PBS 中，然后进行受体染色。

图 1.用于分析 CD4 + T 细胞的门控策略。
(A)用于识别淋巴细胞群 (门控群) 的散射分析。 (B-D)然后对 CD3 +和 CD4 + T 细胞门控淋巴细胞群。右上象限的双阳性群体代表 CD4 + T 细胞。 (B)同型对照抗体仅对一小部分细胞进行染色，从而确认染色的有效性。落在门控区域内的细胞将被视为 CD4 + 。富集之前和(D)之后的PBMC (C) 。虽然预富集的 PBMC 中只有 32.40% 的细胞是 CD4 + ，但这一比例在富集后增加到 94.88%。其他谱系的细胞在 CD4 +细胞富集后随之减少（比较 C 和 D 面板之间的其他象限）。
D. 激活富集的 CD4 + T 细胞
20. 3-5小时后，将上述步骤 10 中的 24 孔板从培养箱中取出并进行细胞活化。
注意：在这个阶段，每个“激活和无激活”井可能在 950 μL 的完整 RPMI 培养基中含有 1 × 10 6 – 1.5 × 10 6富集的 CD4 细胞。
21. 在“激活”井中，在 4 μg/mL（ 100 ng/mL 最终浓度）溶液中加入 25 μL PMA，在40 μg /mL（最终浓度为 1 μg/mL ）溶液中加入25 μL 离子霉素。将 50 μL 的普通 RPMI 介质添加到“无激活”控件中。
22. 将板在 37°C 下孵育12–16小时。
笔记：与“未激活”对照相比，激活将导致细胞聚集。

E. U-蒂尔达
该测定涉及将富集的 CD4 + T 细胞分布到 96 孔簇板中每个细胞浓度的几个复制孔中。这些孔包含逆转录和 PCR 扩增所需的试剂。当孔被加热时，总 RNA 将从细胞中释放到溶液中，直接启动逆转录，无需核酸纯化。在该测定中使用了对病毒转录物特异的三个 RT 引物池，以优先逆转录病毒转录物。细胞相关杂质不会干扰测定中使用的细胞数量的扩增效率。在 cDNA 合成之后，病毒特异性外引物对（N2830 和 N2831）将使用一步 RT-PCR 格式在同一小瓶中扩增病毒靶标。使用内部引物对（N2832 和 N2833）和荧光探针（N2842）将第一轮 PCR 产物稀释并用作第二轮嵌套 PCR 扩增的模板。在实时 PCR 中监测扩增的荧光强度。有关引物设计的更多信息，请参见 Mehta等人。（ 2021 年）。

一步qRT -PCR（第一轮嵌套 PCR）
23. 混合qRT -PCR 的所有组件，如表 2 所示。为 100 个反应准备混合物。
注意：Master-mix 准备了 100 个样品，包括四个额外的样品，以解决样品损失和移液错误。

表 2. 一步式qRT - PCR的 PCR 主混合物
组件库存浓度最终浓度体积 (µL)
N =1 N =100
蒸馏水 - - 2.8 280.0
反应缓冲液 2 × 1 × 5.0 500.0
RT 底漆混合物 2微米 0.1 µM 0.5 50.0
N2830 (FP) 25微米 0.5 µM 0.2 20.0
N2831 (RP) 25微米 0.5 µM 0.2 20.0
核糖核酸酶抑制剂 20 U/µL 0.2 U/µL 0.1 10.0
上标三
铂金Taq 0.5 U/µL 0.01 U/µL 0.2 20.0
总容积 - - 9.0 900.0

24. 图 2 ），将 9 μL 的主混合物分配到 96 孔板的每个孔中。

图 2。 U-TILDA 的板布局。
96 孔板分为两半，“未激活”和“激活”。如图所示，两半都包含三个细胞稀释度，每个稀释度有两列，一个“无模板”对照 (NTC)。

激活后的细胞稀释
25. 在细胞活化 12-16 小时后，将活化细胞和对照细胞转移到两个新鲜的 1.5 mL 微量离心管中，并适当标记。
26. 确定细胞计数。
27. 旋转细胞并重新悬浮颗粒，以便在 37 µL PBS 中获得 1 × 10 6 个细胞的细胞密度（图 3 ）。该细胞密度对应于 27,000 个细胞/ µL。
28. 将 10 μL 的细胞悬浮液转移到下一个含有 20 μL PBS 的小瓶中。该细胞密度对应于 9,000 个细胞/µL。
29. 重复细胞稀释，以获得 3,000 个细胞/µL 的库存。
笔记：
a. 每个细胞稀释使用 16 个复制孔，有或没有细胞活化。
b. 以建议的格式设置检测所需的最小细胞数是 1.62 × 10 6富集的 CD4 + T 细胞。这些悬浮在 37 µL 中的许多细胞（或 0.81 × 10 6 个悬浮在 30 µL 中的细胞）将对应于 27,000 个细胞/µL 的细胞密度。可以按照步骤 28 中的建议完成细胞稀释。

图 3.激活后的细胞稀释。
一百万个细胞悬浮在 37 µL 的 PBS 中（或0.81 × 10 6 个细胞在 30 µL 中），以获得每 µL 27,000 个细胞的细胞密度。按照建议执行连续 3 倍稀释，以获得每 μL 9,000 和 3,000 个细胞的细胞库存。 “未激活”和“激活”样品均使用建议的稀释格式进行稀释。

30. 根据实验格式 (图 2 ), 从准备好的细胞库存中添加 1 µL 的细胞悬浮液到适当的井中。在 NTC 井中加入 1 μL 的 PBS。
31. 用密封膜密封板并将板转移到 PCR 机上。
32. 使用以下条件进行扩增，50℃反转录15分钟，95℃变性2分钟，扩增25个循环（95℃15秒，60℃4分钟）。
33. 放大后，从热循环仪中取出板，将 40 μL 的 TE 缓冲液分配到每个孔中，以稀释第二轮放大的内容。
注意：如有必要，带有稀释样品的板可以在深冰箱中储存数月。

第二轮 PCR 扩增（实时格式）
34. 如图所示，为第二轮 PCR 准备反应主混合物。主混合物足以进行 100 (96 + 4) 次反应（表 3）。
35. 将 9 μL 的主混合物分配到 96 孔 PCR 板的每个孔中。

表 3. 第二轮 qPCR 的 PCR 混合
组件股票集中度最终浓度体积 (µL)
N = 1 N = 100
蒸馏水 - - 2.50 250.00
反应缓冲液 5 × 1 × 2.00 200.00
N2832 (FP) 10微米 2微米 2.00 200.00
N2833 (RP) 10微米 2微米 2.00 200.00
N2842（探头） 5微米 0.12 µM 0.25 25.00
MyTaq HS 聚合酶 5 U/µL 0.12 U/µL 0.25 25.00
总容积 - - 9.00 900.00

36. 从储存中取出第一轮 PCR 的板，让内容物达到室温。
37. 将 1 μL 的稀释模板从第一块板的孔中转移到第二块板上的相应孔中。
38. 将第二块板转移到实时热循环仪。使用以下程序进行 PCR：95°C 预孵育 10 分钟，然后 95°C 10 秒、60°C 30 秒和 72°C 30 秒 40 个循环。
39. 随着扩增的进行，监测荧光强度。
笔记：
a. 预计使用未经冷冻的新鲜细胞裂解物可使 U-TILDA 具有高重现性。查特尔等人。建议直接使用细胞裂解液而不储存样品，以防止 TILDA 敏感性丧失（Châtel 等人，2018 年）。
b. 尽管此处报告了对 TILDA 的优化，但仍有其他选项可用于进一步即兴化验。 RNA 纯化的简单策略可能允许在扩增中添加更多 RNA，从而能够在每个反应孔中检测更多数量的 PBMC (Pezzi et al., 2017) 。不幸的是，RNA 纯化步骤可能会导致额外的成本、样品损失和污染风险。与 Taq 聚合酶相比，其他几种 DNA 聚合酶对样品中杂质存在的耐受性可能更高（Abu Al-Soud 和 Rådström，1998）。使用此类酶可以允许将更多的 RNA 添加到反应中。 U-TILDA的扩增条件，包括引物长度、退火温度、温度梯度以及反应组分的浓度，都已尽可能优化。

数据分析

任何试图表征 HIV-1 宿主的分析的主要目的是量化每百万静息 CD4 + T 细胞的感染单位。 TILDA 检测多重剪接的病毒转录物，因此检测到具有转录活性的原病毒 ( Mehta et al ., 2021 )。然而，具有转录活性事件的受感染 CD4 + T 细胞的预期频率非常小，可能是 10,000 或 100,000 个细胞中的一个事件。该测定进一步假设此类事件的频率在细胞群内均匀分布，并且单个生物活性细胞足以产生来自培养物的阳性反应。鉴于转录能力病毒感染事件的频率极为罕见，该测定需要每孔大量的 CD4 + T 细胞，并通过在每个细胞稀释度中设置几个复制孔。此外，为了估计转录能力病毒感染事件的频率，依赖统计算法是必不可少的。
有限稀释分析基于泊松单次打击模型，它假定每种培养物中生物活性颗粒的数量根据泊松分布而变化。可以使用最大似然估计 (MLE) 计算有限稀释分析的最佳估计（Ahmad 和Parvaiz ，2020 年）。 MLE 是一种基于观测数据估计概率分布参数的方法。这是通过最大化概率函数来实现的，这样观察到的数据在假设的统计模型下是最可能的。 MLE 是使用计算算法获得的，并且有许多基于该算法的软件程序可用。我们使用由 Walter + Eliza Hall 生物信息学医学研究所开发的 ELDA 软件进行分析（Hu 和 Smyth，2009）。

1. 将 qPCR 数据导出到 Excel 表。
2. 在“无激活”和“激活”控制中，分别确定每次稀释时放大阳性的复制井的数量。
3. 在 PCR 扩增之后，将结果制成表格，证明每个实验条件下的阳性孔数（图 4A ）。
4. 访问 ELDA 主页https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/并按照说明输入实验数据。
笔记：
a. 该软件将提供细胞群阳性事件的估计频率（下限、上限和平均估计）（图 4C ）。
b. + T细胞中含有转录活性原病毒的细胞总数可以通过将 1 × 10 6除以使用软件获得的平均估计值来计算。

图 4.量化产生病毒msRNA的细胞频率。
(A)列表 qPCR 数据。数字代表 PCR 后每个孔的 Ct 值。 N/A，没有放大。受试者 S338_02 的数据是从以前的出版物（Mehta等人，2021 年）复制而来的。 (B)为每个细胞数总结了复制井总数中阳性井的比例。请注意，可能需要再进行一轮细胞稀释，因为“激活”下的 15 个孔中有 13 个在 PCR 中呈阳性。 (C)软件返回细胞群阳性事件的估计频率。在细胞激活前后，富集的 CD4 + T 细胞中转录活性病毒感染事件的数量估计分别为 35 和 686。因此，在上述激活条件下观察到产生病毒转录物的感染细胞数量增加了大约 20 倍。

食谱

1. 复兴媒体
RPMI 培养基、2% FBS、20 mM HEPES 和 1 mM EDTA
2. 富集媒体
DPBS、2% FBS 和 1 mM EDTA
3. 染色缓冲液
PBS 中 2% FBS
4. 补充有 10% FBS 的 RPMI 培养基
RPMI 培养基、10% FBS、 100 单位/mL 青霉素 G、2 mM L-谷氨酰胺和 100 μg /mL 链霉素
5. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液
137 mM NaCl、2.7 mM KCl 、10 mM Na 2 HPO 4和 1.8 mM KH 2 PO 4
6. Tris-EDTA (TE) 缓冲液
10 mM Tris-HCl 和 1 mM EDTA•Na 2
7. 40 微克/毫升 PMA
RPMI 培养基中 0.4% 的 1 mg/mL PMA 库存
8. 4 µg/mL 离子霉素
RPMI 培养基中 4% 的 1 mg/mL 离子霉素原液

致谢

这项工作得到了印度政府科学技术部生物技术部（制裁令编号 BT/IN/Netherlands/RG/40/2015）给 UR 和拉吉夫甘地卫生科学大学的资金支持。印度卡纳塔克邦政府（制裁令不。 RGU/高级。 Res/CR/04/2018-19) 给 UR 和 GS。该协议源自我们之前的工作 ( Mehta et al ., 2021)。

利益争夺

作者声明，本文的发表不存在利益冲突或利益冲突。

伦理

班加罗尔贾瓦哈拉尔尼赫鲁高级科学研究中心 (JNCASR) 的人类伦理和生物安全委员会审查了该提案并批准了该研究。在机构审查委员会批准后，所有研究参与者都获得了书面知情同意书。

参考

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