程序

A. 安装

安装Bsoft最简单的方法是从已编译的二进制文件中。要编译它，必须安装几个相关的软件包，潜在的复杂性需要超出典型用户的专业知识。 Bsoft二进制和源代码分发可在http://bsoft.ws免费获得。
1. Linux
在任何版本的 Linux 上，都必须安装Tcl /Tk 和 libxml2 库。在 CentOS 上编译的Bsoft二进制文件应该可以在其他 Linux 发行版上运行。下载名称为 bsoft2_1_0_CentOS_7.8.2003 的存档文件。 tgz（此文件名将随更新而更改）。

Bsoft的典型安装位置是/ usr /local。这通常需要 root 访问权限。如果没有 root 访问权限，在任何其他目录中安装Bsoft也应该可以工作。
切换到安装目录，解压发行版，例如，
tar xzvf bsoft2_1_0_CentOS_7.8.2003.tgz

然后在同一目录中运行安装程序：
./设置
打开另一个 shell，并通过运行bimg或bshow测试安装。一个常见问题是Bsoft程序的路径设置不正确。在bsoft目录中，应该有两个文本文件，分别称为bsoft.bashrc和bsoft.cshrc 。他们设置了一个名为 BSOFT 的变量，该变量应该指向bsoft安装（例如，/ usr /local/ bsoft ）。

2. Mac OSX
下载名为 Bsoft2.dmg 的磁盘映像文件。双击它，然后按照说明进行操作。这通常需要管理权限。邮件包将安装在 / usr /local/ bsoft中，而程序Bshow和 Brun 将安装在 /Applications 中。在终端外壳中，键入bimg和bshow ，以确保程序已正确安装。如果找不到程序，则需要修复环境设置（ /usr/local/bsoft/bsoft.cshrc或/usr/local/bsoft/bsoft.bashrc ），以指向正确的位置。确保 BSOFT 变量指示正确的目录，例如，
BSOFT=/ usr /local/ bsoft

B. 软件程序

Bsoft包含许多图像处理和分子建模程序，主要与电子显微镜数据相关，但也涉及相关领域。大多数程序都是命令行的，有许多选项，并允许广泛使用脚本来处理大量数据。大多数Bsoft程序都是从命令行启动的。这些可以通过 Mac OSX 或 Linux 上的终端应用程序访问，该应用程序打开一个 Unix 类型的 shell。两个程序是交互的。第一个是brun ，一个命令行程序的图形界面，可以更轻松地处理所有选项。第二个是bshow ，用于显示图像的主要图形程序，并处理处理和解释电子显微镜数据的许多方面。

1. 命令行程序
在不带任何选项的命令行上键入程序名称会列出与该程序一起使用的所有选项。例如，键入：
头
它将给出图 1A 中的输出，带有描述和选项。请注意，选项名称区分大小写，如果缩写是唯一的，则可以缩写。

2. 互动节目
a. 布伦
在brun中，可以访问相同的选项。类型：
布伦
然后从程序列表中选择bhead （参见图 1B）。顶部是带有命令行的文本框。通过单击单选按钮选择选项会将它们添加到命令行。可以更改带有参数的选项，以更新命令行。这是构建命令行的一种方法，无需键入选项并获得正确的语法。

图 1. Bsoft程序选项。
(A) 程序bhead的选项只需在命令行中输入其名称即可。 (B) 通过程序brun访问命令行程序，显示程序bhead的输出，以及可以交互输入的选项。

b. 秀
Bsoft中的主要交互程序是bshow （一个基于Tcl /Tk 脚本的Bsoft功能接口）。在 Linux 平台上，它通常以图像文件名启动：
秀输入.mrc &
在 Mac OSX 上，它可以类似地启动，或者可以通过指定多个输入文件来启动多个实例：
bshowX in1.mrc in2.mrc …
它将在以下几个部分中用于检查图像。

C. 图像基础知识

1. 检查地图
a. 示例地图
首先，从电子显微镜数据库（EMDB： https ://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/index.html/）获取cryoEM图。这些地图可以很大，所以最好选择小地图，这样处理时间不会很长。我选择了人类高铁血红蛋白 ( EMD-0407 ) (Herzik et al. , 2019) ，这是通过cryoEM解决的最小蛋白质之一。完整的包大约 208 MB，包含多个文件。在 UCSF Chimera 中打开地图和模型（文件 map/emd_0407.map 和fitModels /PDB/6nbc.ent），应该会产生如图 2 所示的显示。它显示出清晰的 C2（循环二重）对称性，正如预期的血红蛋白。该模型适合密度，但有些部分可能不太适合。背景也有很多来自嘈杂的显微照片的“灰尘”。

b. 地图文件的命令行检查
导航到地图目录并键入以下内容：
bhead -verb 7 emd_0407.map
这将产生如图 2 插图所示的输出。所有Bsoft程序中的-verbose选项控制生成多少输出。如果不使用，则不会生成输出。这通常用于脚本中以不产生大量输出。参数 1 给出了最小的输出，这通常是执行大量处理的程序所需要的。读取图像文件时，输出中最重要的部分是图像数量、以像素/体素为单位的尺寸以及通道数。通道数表示每个体素的数据值数量，这只是典型的cryoEM地图的一个。 Bsoft还可以分别理解具有两个和三个通道的复杂和彩色图像。此外，通道与复合类型有关，最常见的类型有“简单”（灰度或一个通道）、“复杂”（2 个通道）和“RGB”（3 通道颜色）。数据类型很重要，因为它可能导致某些操作产生奇怪或不希望的结果。在大多数情况下，每个值占用 4 字节存储空间的浮点数据类型是最合适的类型。但是，对于非常大的显微照片，可以将数据编码为单字节整数值 (0–255)，以节省空间。 Bsoft中的大多数程序都有更改数据类型的选项。

像素/体素单位或采样在cryoEM中至关重要，因为它们将图像比例与真实的物理比例联系起来。建议在任何数据处理协议中尽早设置正确的像素/体素大小。配置良好的数据采集通常包括图像标题中的采样，但有时在处理图像时需要明确给出。

输出中的另一行以最小值、最大值、平均值和标准差给出图像的整体统计信息。这提供了一个简单的检查，以确保图像具有预期分布的数据。这可以强制更新：
bhead -verb 7 -重新计算emd_0407.map

来自其他软件包的文本标签可能包含各种信息，有些有用，但大多没有。在Bsoft中，生成文件的命令行被写入文本标签。因此，几乎总是可以检索用于生成图像的确切命令。

图 2. EMDB 条目 0407。
UCSF 嵌合体中呈现的人类高铁血红蛋白 (Pettersen et al. , 2004)及其原子模型 (PDB: 4N7P)。插图显示了地图的信息，使用命令行： bhead -verb 7 emd_0407.map 。

c. bshow中检查地图
在交互式程序中打开地图：
bshow emd_0407.map
初始显示（图 3A）令人失望，因为人们希望看到一些不错的密度。但是，原点设置为 (0,0,0)。要解决此问题，请选择菜单项“图像/设置原点”，然后单击对话框中的“中心”按钮。原点现在是 (128,128,128)（图 3B）。将“切片”滑块移动到 128，以显示切片 128，原点由蓝色圆圈表示。可以移动“Min”和“Max”滑块，以更改显示密度范围。请注意，这些操作都不会改变地图数据，只是改变它的显示方式。单击“动画”按钮开始循环遍历切片。 bshow中有许多处理图像的功能，包括简单的图像操作，以及显微照片处理所需的更复杂的操作。其中大部分以及更多可以从命令行处理。

“文件/文件浏览器”菜单项打开一个窗口，方便选择要打开的文件。它显示了启动bshow的目录的内容。
bshow中的菜单处理不同的方面（图 4C）：
1. 文件：读取/写入图像文件并获取信息。
2. 图像：处理图像数据。
3. 显微照片：处理与显微照片相关的参数元数据。
4. 模型：处理基于 3D 重建的模型。
5. 窗口：可用和打开的窗口列表。
6. 帮助：信息和偏好。

该协议主要涵盖前两个菜单的使用。

图 3.在bshow中显示。
(A) 在 bshow 中默认显示来自 EMDB 的地图emd_0407 。 (B) 固定原点后显示地图。 (C) bshow中的菜单，如 Mac OSX 中所示。

d. 直方图
图像中值的分布以直方图的形式捕获，其中值的范围被划分为多个bin，并对每个 bin 内的值进行计数。在bshow中，选择“Image/Histogram”菜单项打开直方图（图 4）。

图 4. 重新缩放地图 emd_0407 的直方图。
可以通过用鼠标选择一个矩形来检查直方图的某些部分。

2. 图像格式
Bsoft 多年前就开始处理所有不同的图像格式。目的是尽可能地遵守每种格式的规范。因此，通过使用Bsoft程序重写来自其他软件的图像来修复它们，可以解决许多问题。格式由文件扩展名标识，即最后一个句点之后的部分。因此，始终有一个文件的扩展名总是很重要的。此外，文件名中的空格和奇怪字符（例如“ -” 、“/”、“&”和“$”）会给命令行程序带来问题。请不要在名称中使用空格或特殊字符。

cryoEM中最重要的格式是 MRC（医学研究委员会）格式（扩展名： .mrc 、 .mrcs ），在其最新规范中，可以对大部分信息进行编码（Cheng等人，2015 年）。密切相关的 CCP4 格式（扩展名： .map ）应该与 MRC 格式兼容，但存在细微差别。支持许多其他格式，包括 TIFF、PNG 和 JPEG 等颜色格式。请注意，并非所有格式都支持所有数据类型，并且在重写为新格式时可能需要更改数据类型。如果需要将许多图像更改为新格式，请使用程序bconvert 。

3. 切片 vs 。图片
软件包通常不区分一组 2D 图像和 3D 图像切片。但是，从数据处理的角度来看，重要的是要了解操作是否将应用于 2D 图像或 3D 体积。在Bsoft中，2D 图像和 3D 体积切片之间的区别是明确的，并在标题输出中指示（图 1）。在切片和图像切换的地方，可以在几个程序中进行纠正。

从切片到 2D 图像：
bhead -verb 7 -images in.mrc 出.mrc
从一堆 2D 图像到 3D 切片：
bhead -verb 7 -slices in.mrc 出.mrc

4. 剪辑
可以对具有 3D 地图或多个 2D 图像的文件进行蒙太奇，即以 2D 阵列显示（图 5）。可以将此蒙太奇保存到图像中以包含在文档中。使用命令行程序bmontage可以获得相同的结果。

图 5。 bshow 中地图 emd_0407 的切片蒙太奇。

5. 分割图像
文件中的 3D 图像或多个图像的切片可以分成单独的文件：
bsplit -verb 7 -images -select 100,110-120 emd_0407.map split/emd_0407.mrc
请注意， -images 选项会将图像重新解释为 2D 图像以进行分割。省略 -select 选项会导致将所有切片生成为单独的 2D 图像。

6. 组合图像
图像可以合并为一个文件，调整为图像的最大尺寸：
bcat -verb 7 -slices -out emd_0407_cat.mrc split/*. MRC
-slices 选项指定应将图像打包为 3D 图像的切片。

D. 图像处理

1. 几何运算
图像上最常用的操作涉及几何变换、平移、旋转和缩放。 Bsoft中的程序旨在让用户完全控制所有方面，但这需要理解约定。
因为原点非常重要，所以可以使用以下方法检查地图中的原点：
bhead -verb 7 -info emd_0407.map
做几何运算的主要程序是bint （插值）。
要翻译地图，请键入以下命令：
bint -动词 7 - ori cen -trans -100,100,0 emd_0407.map emd_0407_t.mrc
“-origin”选项将原点设置为地图的中心。这很重要，因为大多数操作都取决于它的设置方式。 “-translate”选项将地图移动指定的体素数量。在这种情况下，它会将其移动到左上角，切割部分密度。另请注意，已调整原点以反映此移动。

原点对于旋转特别重要，因为它指定了旋转的中心。
要旋转地图，请键入以下命令：
bint -动词 7 - ori cen -旋转 0,0,1,33 emd_0407.map emd_0407_r.mrc
旋转由 3 值旋转轴 [在本例中为 z 轴 (0,0,1)] 和以度为单位的旋转角度指定。

要更改地图比例，请键入以下命令：
bint -动词 7 - ori cen -scale 0.5,0.5,0.5 -size 128,128,128 -trans - 64,- 64,-64 emd_0407.map emd_0407_s.mrc
与旋转一样，比例的变化是在原点附近。这意味着，如果我们想将其放入更小的尺寸，我们还必须正确翻译它。这个命令行的结果现在在新地图的中心有原点，采样是原来的两倍。这三个转换可以同时进行。

2. 装箱
图像通常通过 binning 重新缩放，这是一种通过整数因子重新缩放的形式。
最常见的是按 2 分箱，即平均每 2 × 2像素或 2 × 2 × 2 体素：
bint -verb 7 -bin 2 emd_0407.map emd_0407_b2.mrc
这种分箱是各向同性的，但也可以通过为每个维度指定分箱因子来完成各向异性分箱。

3. 密度操作
图像处理是关于操纵图像中的数据。一些简单的操作会改变密度分布，目的是消除问题，或设置具有特定特征的分布。程序bimg具有截断数据的选项（消除高于和低于阈值的值），或将最小值和最大值设置为所需值。
Bsoft中广泛使用的操作是将平均值设置为零，将标准偏差设置为 1：
bimg -动词 7 - ori cen -rescale 0,1 emd_0407.map emd_0407_rs.mrc
现在密度分布已经很好地定义了，许多后续操作都可以正常工作。

cryoEM的显微照片显示生物分子在稍浅的背景上呈深色，即，较低的值表示密度（也称为负密度）。在解释密度时，直觉是具有更高的值表示更大的密度（即，正密度）。我们示例的地图作为正密度图存储在 EMDB 中。要查看与显微照片中看到的密度相对应的原始重建地图的样子，必须反转地图（图 6A）：
bimg -动词 7 - ori cen -反转 emd_0407.map emd_0407_i.mrc

有时，图像中的极值非常大，对信息内容没有贡献。
可以通过截断将极值修改为更合理的值，或增强显示对比度：
bimg -verb 7 - trunc -0.05,0.05 emd_0407.map emd_0407_tr.mrc

图像也可以通过简单的操作来调整，例如通过添加一个常数来移动密度值，或者将密度值乘以一个常数：
bar -verb 7 -add 0.1 - mult 10 emd_0407.map emd_0407_am.mrc

4. 颜色
Bsoft支持各种可以存储颜色编码的图像格式（TIFF、JPEG、PNG 或 GRD）。颜色通常用于更好地显示地图中的差异。
一种转换是红蓝过渡（图 6B）：
bcolour -verb 7 -verb 7 - rwb - 10,- 0.1,0.1,10 emd_0407_rs.mrc emd_0407_rs_rwb.tif
请注意，原点是 (0,0,0)，因为 TIFF 格式不包括用于指定它的字段。

图 6. 操作地图 emd_0407。
(A) 倒置地图。 (B) 红蓝色地图。

5. 添加图像
有各种程序可以相互添加图像。
如果图像在一个文件中，则可以将它们总结为：
bimg -verb 7 -images -sum emd_0407.map emd_0407_sum.mrc
请注意，这里我们将 3D 体积的切片解释为单独的 2D 图像。结果是地图在 z 方向上的投影（有关投影的更多信息，请参见下文）。 -average 选项与 sum 相同，只是它将结果除以原始图像的数量。

在cryoEM中，我们通常会生成两个“半图”，每个图都是根据原始数据集的独立一半计算得出的。
要将示例中的两个半图相加，请执行以下操作：
bop -verb 7 -add 1,0 emd_0407_half_map_1.map emd_0407_half_map_2.map emd_0407_full.map

如果我们想在不同的文件中添加多个图像，我们可以使用通配符（“?”和“*”）来指定一组文件：
badd -verb 7 -out emd_0407_sum.mrc emd_0407_half_map _?。地图

6. 图像相乘
cryoEM中用于图像倍增的最常见原因是应用掩码。
在我们的示例中，我们可以将地图与提供的掩码相乘：
bop -verb 7 - mult 1,0 emd_0407.map ../masks/emd_0407_msk_1.map emd_0407_masked.mrc

7. 差异图像
如果我们有来自不同样本组成的地图，我们通常希望看到地图的差异。
最简单的比较是从另一个中减去一个：
bop -verb 7 -add -1,0 emd_0407_half_map_1.map emd_0407_half_map_2.map emd_0407_dif.map
请注意，在这种情况下，地图的分辨率相对较高，因此差异地图除了噪声之外没有显示太多。

8. 构建图像
有时我们想生成一个合成图像用作参考或掩码。最简单的方法是将模糊球体放入一个体积中。
例如，让我们将一个球体放入一个盒子中：
beditimg -v 7 -create 100,100,100 -origin 50,50,50 -sphere 35,35,38,12 -edge 3 -fill 1 spot1.mrc
球体现在位于体素 (35,35,38) 处，半径为 12 个体素，软边缘为 3 个体素。 “-fill”选项是必需的，以指定球体内的极值（否则图像将只是空的）。
我们可以添加另一个球体：
beditimg -v 7 -sphere 21,40,38,2 -edge 1 -fill 1 spot1.mrc spot2.mrc
如果预期图像具有对称性，我们可以应用它（图 7）：
bsym -verb 7 - sym D5 spot2.mrc d5.mrc

图 7. 由两个具有 D5 对称性的球体组成的合成地图。

9. 具有随机内容和噪声的图像
可以生成几种类型的随机图像。
最简单的是均匀分布（图 8A）：
Brandom -verb 7 -size 256,256,1 -type uni 制服.mrc

在cryoEM中，数据大多符合泊松分布，也称为散粒噪声或量子噪声（图 8B）：
Brandom -verb 7 -size 256,256,1 -type pois -avg 3 poisson.mrc
在较大的平均值上，泊松分布接近高斯分布。
要生成高斯分布，请执行（图 8C）：
Brandom -verb 7 -size 256,256,1 -type gaus -avg 9,3 gauss.mrc
高斯分布也称为白噪声，因为它的频谱分布接近恒定功率。
要生成具有不同光谱分布的随机图像，例如棕色噪声，请执行以下操作（图 8E）：
Brandom -verb 7 -size 256,256,1 -type spec -alpha 2 brown.mrc
要生成粉红噪声（图 8D），请将 alpha 值设置为 1，对于蓝色噪声（图 8F），将其设置为 -1。

图 8. 随机图像。
（统一。 (B) 泊松/散粒/量子噪声。 (C) 高斯/白噪声。 (D) 粉红噪声。 (E) 红/棕噪声。 (F) 蓝色噪声。

10. 点群对称
cryoEM中处理的孤立生物分子的对称性主要是点群对称性。五类点群对称性如图 9A 所示。对称性使用了各种符号，其中显示的符号在Bsoft中采用。
例如，二十面体图的创建如下：
beditimg -v 7 -create 100,100,100 -origin 50,50,50 -sphere 33,33,38,8 -edge 3 -fill 1 spot1.map
beditimg -v 7 -sphere 19,38,38,2 -edge 1 -fill 1 spot1.map spot2.map
bsym -verb 7 - sym I spot2.map ico.map

11. 螺旋对称
螺旋丝有自己的对称性。任何螺旋的基本对称性都可以表示为上升和每个亚基的旋转。
图 9B 所示的第一个螺旋创建如下：
beditimg -v 7 -create 200,200,200 - ori 100,100,100 - sam 2 - sph 110,100,100,10 -fill 1 -edge 2 sph1.map
beditimg -v 7 - sph 120,110,100,2 -fill 1 -edge 2 sph1.map sph2.map
bhelix -v 7 -helix 40,66 - zlim 180,220 sph2l2.map hel2.map
bimg -v 7 -size 200,200,400 -trans 0,0,100 sph2.map sph2l2.map
bhelix -v 7 -helix 40,66 - zlim 180,220 sph2l2.map hel2.map
此外，螺旋可以具有更多的对称性或特征。第一个是二重轴，这表明螺旋的两个方向是 2 重对称相关的。第二个是它可以具有循环对称性，通常具有多个原丝有助于复合螺旋。图 9B 显示了这样一个螺旋，右侧有五个原丝。
它是从上面创建的 sph2l2.map 生成的，如下所示：
bint -verb 7 -trans 10,0,0 - newori center sph2l2.map sph2l2t.mrc
bhelix -v 7 -helix 40,66,1,5 - zlim 180,220 sph2l2t.mrc hel2c5.mrc

图 9. 具有不同对称性的合成图。
(A)点群对称性：C5：5倍循环； D5：5倍二面角； T：四面体； O：八面体；我：二十面体。这些模型显示了相应的柏拉图立体：四面体、立方体、八面体、十二面体和二十面体。 (B) 螺旋对称：左：H40,66（上升 40Å，旋转 66°）；右图：H40.66,1,5（上升 40Å，旋转 66°，无对子，循环 5 倍）。

E. 傅里叶变换和频率空间

1. 傅里叶变换
图像处理中最重要的操作之一是傅里叶变换。图像的傅里叶变换是频率空间中数据的表示。这类似于通过频谱来表示音频信号。变换是线性的，这意味着我们可以对其进行反向变换以准确地恢复原始图像。
使用bfft计算正向变换：
bfft -v 7 emd_0407_rs.mrc emd_0407_rs_ft.mrc
生成的图像是复杂的，这需要一种可以存储复杂值的图像格式（例如 MRC、Spider、 Imagic等）。
反向变换应该恢复原始地图：
bfft -v 7 -inv emd_0407_rs_ft.mrc emd_0407_rs_bft.mrc
2. 功率谱
功率谱是傅里叶变换的强度（即，没有相位），并且近似于在电子显微镜的后焦平面中获得的衍射图案（从技术上讲，它近似于弗劳恩霍夫衍射）。功率谱告诉我们很多关于图像质量的信息，以及它是如何形成的。在cryoEM中，地图的分辨率被松散地定义为对应于具有可靠数据的最大空间频率。

可以使用bfft （使用-powerspectrum选项）或在bshow中打开图像后计算功率谱。在bshow中，选择“图像/功率谱”菜单项，弹出一个对话框（图 10）。 “对数”选项计算功率谱的对数，以减小动态范围，使其更易于解释。点击“OK”计算功率谱。请注意，右上角的“图像类型”变为“ ps ”，表示它是功率谱。在此示例中，功率谱明显被截断。将鼠标悬停在被截断的边缘上会在右侧的“距离”字段中给出相应的分辨率值。

图 10. 地图 emd_0407 的功率谱（对数）。
2.8 Å 处的截止是低通滤波器将所有高频外壳归零的结果。

F. 图像过滤器

过滤器改变图像中的强度分布，通常用于更好地解释图像内容。必须注意不要如此剧烈地改变图像，以免产生伪影。滤波器可以应用于实空间或频率空间。在现实空间中，这通常采用特定大小的内核的形式，应用于每个体素（即卷积）。在频率空间中，滤波器具有傅里叶变换，即乘以图像的傅里叶变换。

1. 带通/低通/高通滤波器
图像处理中最重要的滤波器可能是带通滤波器。它在两个分辨率限制之间的傅里叶变换中选择某个频率范围，并将其他所有内容设置为零。带通滤波器的两个特殊情况是低通滤波器（低于高分辨率限制的所有内容）和高通滤波器（高于低分辨率限制的所有内容）。
使用bfilter施加带通滤波器（图 11B）：
bfilter -verb 7 -band 5,20 emd_0407_rs.mrc emd_0407_rs_bp.mrc
过滤器的作用是减少整个图像的大规模强度变化（由较大的值设置），并平滑或模糊局部变化（由较小的值设置）。后者的主要目的是去除主导高频的不需要的噪声。请注意，滤波会导致背景中的振荡或条纹，随着高分辨率限制值的增大而增加。

2. 平均滤波器
最简单和最快的基于实空间内核的滤波器是平均滤波器。对于每个体素，它将图像中内核大小内的所有值相加，并将平均值分配给新图像的中心体素。在bshow中，选择“图像/滤镜”菜单项。选择“平均”类型，将内核大小设置为 7，然后单击过滤器（图 11C）。结果类似于带通滤波器的平滑，但背景现在更加均匀。

图 11。过滤。
(A) emd_0407 的原始图。 (B) 以 5 Å 和 20 Å 的分辨率限制过滤的地图带通。 (C) 使用 7 x 7 x 7 体素平均内核过滤的地图。比例尺：50 Å。

G. 互相关

图像处理中最重要的操作之一是两幅图像的互相关，用于将一幅图像与另一幅图像对齐。这是cryoEM中电子显微照片处理的许多部分的基础。它通常在频率空间中完成，以加快计算速度。在Bsoft中，频率空间的使用允许指定分辨率限制，以避免噪声对结果的过度影响。这有效地将带通滤波器与相关分析相结合，以强调那些具有高信噪比的频率。
为了说明这一点，我们可以将地图移动一些任意向量：
宾特-verb 7 -trans -2,3。 5,- 1.5 emd_0407_rs.mrc emd_0407_t3.mrc
然后我们使用保守的分辨率限制将其与原始数据进行交叉关联
bcc -verb 7 - resol 5,50 -Cross emd_0407_rs.mrc -Map emd_0407_cc.mrc emd_0407_t3.mrc

shell 的输出显示了合成向量和相关系数 (CC)：
图片 dx dy dz 抄送磷
1 2.0010 -3.5865 1.4239 0.9828 0.9973

请注意，结果向量是应用向量的负数，因为它表示返回到原始位置。图 12A 显示了互相关图，其中右下角的峰值对应于确定的移位向量。这种情况下的峰非常尖锐，表明对齐非常准确。要查看地图中的背景，可以使用bshow中的最小/最大滑块重新缩放（图 12B）。该地图的原点可以通过“图像/中心原点”菜单项放置在图像的中心（图 12C）。

图 12. 互相关图。
(A) 互相关图在右下角显示对应于偏移向量的峰值。 (B) 互相关图的重新缩放版本，以更好地显示相关性较低的区域。 (C) 相同的地图，但以峰为中心。比例尺：50 Å。

H. 面具

我们使用掩码来指示图像中的特定区域，以消除我们不感兴趣的部分，或限制计算。面具可以有不同的形式，具体取决于我们如何使用它们（表 1）。
为了制作二进制掩码，我们选择一个阈值并使用以下命令生成它：
bmask -verb 7 -threshold 2.2 emd_0407_rs.mrc emd_0407_mask.mrc
图 13A 中的二进制掩码有很多高于阈值的背景噪声。
要删除它，我们可以应用打开操作（图 13B）：
bmask -verb 7 -open 1 emd_0407_mask.mrc emd_0407_mask_o1.mrc
二元掩码的基本操作是膨胀和腐蚀。膨胀将体素添加到蒙版的边缘以放大它，而腐蚀则删除边缘的体素以减小它。开运算应用一次或多次腐蚀迭代，然后是膨胀。关闭操作将应用一次或多次膨胀迭代，然后是腐蚀。这些操作的目的是更好地定义遮罩的范围，以便我们可以更恰当地覆盖地图中的结构，并消除噪声。

在某些情况下，我们希望在掩码内用不同的值指示不同的区域。生成多级掩码的一种简单方法是指定阈值（图 13C）：
bmultimask -verb 7 -threshold - 4,- 2,0,2,4 emd_0407_rs.mrc emd_0407_mlm.mrc
多级掩码在我们想要分割地图以指示不同部分时非常有用。虽然Bsoft有多种分割工具，但这是一个非常复杂的话题，这里不再赘述。

表 1. 掩码

面罩类型值范围典型预期用途
二进制 0 和 1 前景-背景（例如，结构的一部分）
多层次整数：0… 分割结果，互斥区域
位级整数：0… 分割结果，重叠区域
模糊 0-1 应用具有柔和边缘的蒙版

图 13. 面具。
(A) 从 emd_0407 生成的二进制掩码。 (B) 相同的面罩，但具有额外的打开操作以消除噪音。 (C) 多级掩码。比例尺：50 Å。

I. 径向函数

1. 实空间径向剖面
对于许多具有球形形状的颗粒（例如病毒衣壳），径向轮廓是有指导意义的，以划分颗粒的层或壳。
这是使用 Postscript 格式的输出计算得出的（请注意，必须在地图标题中正确指定原点和采样）：
bradial -verb 7 -radial -Post emd_22333_rad.ps emd_22333.map
图 14A 显示了沙门氏菌噬菌体 SPN3US 的“斑驳”衣壳的径向剖面（Heymann等人，2020）。右侧的三个峰对应于结构化的蛋白质壳，而左侧的高密度表明衣壳中心的结构较少。

2. 径向功率谱
图像或地图的径向功率谱给出了不同频率或分辨率外壳下的强度或功率，表明图像中有多少细节：
bradial -verb 7 - Radialps 7 -log -Post emd_22333_rps.ps emd_22333.map
在这里，功率谱计算为 7 Å，因为除此之外没有太多信息。功率也转换为其对数，以更好地显示高动态范围（图 14B）。 Postscript 文件是一个文本文件，其中包含一个包含数据的表。这可以在绘图程序中读取（这里，我使用Kaleidagraph ），用不同的轴重新绘制它（图 14B 插图）。

图 14. 地图 emd_22333 的径向剖面。
(A) 实际空间中的径向平均剖面，显示衣壳壳为最高峰，内部有其他峰和密度。 (B) 具有高动态范围的径向功率谱（对数）。可以提取文本 Postscript 文件中的数据并以不同的范围（插图）重新绘制。

3. 径向截面
虽然径向剖面提供信息，但径向截面旨在呈现每个半径处的横向信息。
对于简单的球壳，操作很简单：
bradial -verb 7 -shells emd_22333.map emd_22333_sh.mrc
图 15A 显示了 SPN3US 衣壳的两个径向截面（Heymann等人，2020）。因为衣壳不完全是球形，而是二十面体，所以顶点看起来与其他顶点不同。
为了补偿二十面体形状，可以进行更复杂的计算：
bradsec -verb 7 - sym I-3 -frac 0.3 emd_22333.map emd_22333_radsec.mrc
在这里，对称性被指定为表示二十面体的 3 折面有些扁平，球形度分数为 0.3（图 15B）。

图 15. 地图 emd_22333 的径向部分。
(A) 537 和 625 的各向同性径向截面。 (B) 二十面体对称的对称调整径向截面，不包括 (A) 中所示半径相似的 3 倍轴。

4. 圆柱形展开
使用丝状颗粒，圆柱体周围的不同层在展开时可以更好地显示：
bcyl -verb 7 -unwrap 1 -重新切片z- yx emd_4802.map emd_4802_uw.mrc
reslicing选项切换轴，可用于在展开后获得所需的显示方向。图 21 显示了昆虫沙雷氏菌抗摄食原噬菌体展开图的三个正交视图（Desfosses等人，2019 年）。左上角的面板给人以螺旋重复图案的好印象。

图 16.展开螺旋细丝，映射 emd_4802 。
bshow中的“窗口/放大”菜单项查看。

J. 预测

虽然结构生物学中的地图是 3D 的，但原始数据是 2D 的。因此，我们希望能够将 3D 地图的投影与 2D 图像进行比较。
1. 真实空间投影
最简单的方法是计算 3D 地图中每个投影方向上的密度平均值。通常，我们对地图不对称单元内的一组独特视图感兴趣。选择投影方向以形成以度为单位的给定步长的规则分布：
bproject -verb 7 -angles 30 - sym C2 emd_0407_rs.mrc emd_0407_rs_proj.mrc
图 17A 显示了在实际空间中生成的一组投影，这些投影限于粒子的 2 倍不对称单元。

2. 频率空间投影
生成投影的更好方法是使用中心部分定理在频率空间中计算它们（图 17B）：
bproject -verb 7 -kernel 8,2 -angles 30 - sym C2 emd_0407_rs.mrc emd_0407_rs_proj_fs.mrc
内核用于频率空间插值（Lanzavecchia 和 Bellon，1995）。
我们可以比较这两种方法：
bop -verb 7 -fit 0 emd_0407_rs_proj.mrc emd_0407_rs_proj_fs.mrc emd_0407_rs_proj_dif.mrc
在原始和最终采样之间存在一些由莫尔图案产生的伪影（例如，图 17C 中的投影 28）。

图 17. 地图 emd_0407 的投影。
(A) 真实空间投影。 (B) 频率空间预测。 (C) 真实和频率空间投影之间的差异图像显示可能影响处理（例如在cryoEM中使用）的显着伪影。

K. Bsoft中的其他功能

Bsoft背后的主要目的是为结构生物学提供工具，就像电子显微镜一样。两个主要领域是 ( i )通过单粒子分析对生物分子进行高分辨率结构测定和 (ii) 电子断层扫描，以可视化生物复合物和细胞亚结构。首先，请参阅单粒子分析的一般描述(Heymann, 2018a) 、验证结果的方法(Heymann, 2015) 、验证重建的演示(Heymann, 2018b)以及特定案例的详细协议(Heymann , 2020) 。对于断层扫描，请参见原始论文(Heymann et al. , 2008)以及Bsoft中的当前状态（海曼，2021）。 Bsoft的未来愿景是继续开发cryoEM中的单粒子分析，并使用电子断层扫描在细胞环境中整合分子细节。

笔记

1. 安装Bsoft后的一个常见问题是可执行文件（程序）的路径格式不正确，导致无法找到它们。这些通常设置在 / etc /profile 或/etc/csh.cshrc文件中，具体取决于所使用的操作系统和 shell。
在它们中，它们应该引用bsoft.bashrc或bsoft.cshrc文件，例如.,
源/usr/local/bsoft/bsoft.bashrc _ _ _ _
2. Bsoft 中的交互程序 bshow和brun依赖于系统Tcl / Tk 安装。如果安装了重定向到不同版本的Tcl /Tk的任何其他软件包，它可能会阻止Bsoft程序运行。唯一的补救措施是重置到系统Tcl /Tk 的链接。这又取决于系统的配置方式，超出了这里的范围。
3. 图像格式的识别取决于文件名的扩展名，例如. mrc或 .tiff（即.，最后一个句点之后的字符）。
4. 许多图像格式不支持广泛的数据类型。因此，至少了解一些有关图像格式的细节非常重要。例如，TIFF 规范包括Bsoft支持的各种数据类型。但是，许多其他程序只能读取数据类型为byte或 short 的 TIFF 文件。浮点格式的文件可以通过许多Bsoft程序转换为字节，但必须理解，这会重新调整图像中的值以适应字节。它可能会产生显着降低图像质量的后果。为防止这种情况，请使用 bimg 中的 -rescale 和 -truncate 选项将图像转换为可接受的形式。
5. 图像的解释，尤其是在cryoEM中，取决于像素或体素大小的正确规范。这通常不存在，或者在从其他软件包派生的图像中未正确指定。在Bsoft程序中，使用 -sampling 选项正确设置它。可以取三个值来表示各向异性采样。
6. 任何几何操作都取决于原点的正确规范。在Bsoft程序中，使用 -origin 选项进行设置。 “中心”的参数将原点放在图像的中心。
7. 比较任何两个或更多图像要求它们具有相同的大小和缩放比例。它们还必须具有相同的强度分布，使得白色对应于白色，黑色对应于黑色。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所的校内研究计划的支持。

利益争夺

作者没有相互竞争的利益。

参考

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Cheng, A., Henderson, R., Mastronarde , D., Ludtke , SJ, Schoenmakers , RH, Short, J., Marabini , R., Dallakyan , S., Agard , D. 和 Winn, M. (2015) . MRC2014：电子冷冻显微镜和断层扫描的 MRC 格式标头的扩展。结构生物学杂志192（2）：146-150。
Desfosses ，A.，Venugopal，H.，Joshi，T.，Felix，J.，Jessop，M.， Jeong ，H.，Hyun，J.， Heymann ，JB，Hurst，MRH等。（2019）。整个收缩注射系统在伸展和收缩状态下的原子结构。天然微生物4(11)：1885-1894。
Herzik , MA, Jr., Wu, M. 和 Lander, GC (2019)。使用常规冷冻电镜对低于 100 kDa 的复合物进行高分辨率结构测定。国家通讯10（1）：1032 。
海曼，JB (2001)。 Bsoft：电子显微镜中的图像和分子处理。结构生物学杂志133（2-3）：156-169。
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海曼，JB（2018a）。使用 Bsoft 从电子显微照片中对生物分子结构进行高分辨率重建和验证的指南。蛋白质科学27（1）：159-171。
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海曼，JB（2020 年）。使用 Bsoft 处理和解释 cryoEM 数据的协议：视网膜粘附蛋白 Retinoschisin 的案例研究。生物协议10(2)：e3491。
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