材料和试剂

1. 150 × 21 mm Dish， Nunclon TM Delta（ Thermo Fisher，目录号：168381）
2. AccuPrime TM Taq DNA 聚合酶系统（Thermo Fisher，目录号：12339016 。收到后，在 -20°C 下储存）
3. 凝胶加载染料，蓝色（6 × ）[ New England Biolabs，目录号：B7021S。收到后，在室温 (RT) 下储存]
4. 5% Mini-PROTEAN ® TBE Gel，10孔（ Bio-Rad ，目录号：4565014 。收到后，在 4°C 下储存）
5. Pierce TM 10 × TBE 缓冲液（Thermo Fisher，目录号：28355 。收到后，储存在 RT ）
6. TE 缓冲液（Thermo Fisher，目录号：12090015 。收到后，储存在 RT ）
7. 10,000 × 凝胶之星核酸凝胶染色剂（Lonza，目录号：50535 。收到后，储存在-20°C ）
8. 低分子量 DNA 梯（New England Biolabs，目录号：N3233S。收到后，在 -20°C 下储存）
9. NE-PER TM核和细胞质提取试剂（Thermo Fisher，目录号：78833 。收到后，在 4°C 下储存）
10. Roche cOmplete ，Mini Protease Inhibitor Cocktail（25 片）（Emerald Scientific，目录号：11836153001 。收到后，在 4°C 下储存）
11. LightShift TM化学发光 EMSA 试剂盒（Thermo Fisher，目录号：20184 。收到后，将试剂盒组分储存在 -20°C 下，化学发光试剂除外，如制造商所述在 4 °C 下储存）
12. Herculase II Fusion DNA Polymerases（Agilent，目录号：600677 。收到后，储存在-20°C ）
13. UltraPure TM琼脂糖（ Thermo Fisher，目录号：16500100 。收到后，储存在 RT）
14. Safe-Red（ APPLIED BIOLOGICAL MATERIALS INC，目录号：G108-R。收到后，储存在 -20°C）
15. 所有引物均购自 Integrated DNA Technologies (IDT) 作为标准配方
16. Gibco TM DPBS，不含钙，不含镁（Gibco，目录号：14190235 。收到后，储存在 RT）
17. 原代人动脉EC（Lonza，目录号：CC-2535）
18. EGM TM -2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKit TM （Lonza，目录号：CC-3162）
19. 0. 5 × TBE 缓冲液（见配方）
20. 1 × 凝胶之星（见食谱）
21. 1 ×低分子量 DNA 梯（见食谱）
22. 10% TE 缓冲液（见配方）
23. 1.5% 琼脂糖凝胶（见食谱）

设备

1. T100 热循环仪（ Bio-Rad ，目录号：1861096）
2. PowerPac TM基本电源（ Bio-Rad ，目录号：1645050）
3. Mini-PROTEAN ® Tetra 垂直电泳槽（ Bio-Rad ，目录号： 1658003FC ）
4. Eppendorf ThermoMixer TM C（Fisher Scientific，目录号： 13527550）
5. Thermo Scientific Savant DNA 120 SpeedVac浓缩器（ Thermo Scientific，目录号：BZ10133848）
6. BLook TM LED Transilluminator（ GeneDireX ，目录号：BK001）
7. Implen C40 NanoPhotometer UV/Vis 分光光度计移动系统，110/220 V（Cole-Parmer，目录号：UX-83070-62）
8. 细胞刮刀（VWR，目录号：15621-005）
9. VWR 人体工学高性能移液器套件（VWR，目录号：89079-970）
10. Thermo Forma Steri Cycle 370 CO 2培养箱（Marshall Scientific，目录号：TH-370）
11. Allegra ® X-5 临床台式 IVD 离心机，Beckman Coulter ® （VWR，目录号：89429-566）

手续_

Reel-seq 的简化流程图如图 1 所示。

图1. Reel-seq 的简化流程图

A. DNA文库1和2的构建和生成
1. 从 NCBI网站( https://www.ncbi.nlm.nih.gov )下载感兴趣的基因组DNA 序列。
2. All Databases向下滚动到Gene。
3. 输入您感兴趣的基因名称，例如，CDKN2A。
4. 搜索结果中选择基因。
5. Genomic region, transcripts, and products下选择FASTA 。
6. 定义序列的区域，通过输入染色体上的核苷酸数，您的基因位于屏幕右侧显示的更改区域下。例如，从 2230356 到 22172015，对于 9 号染色体上的 58 kb CDKN2A 区域。
7. 单击更新视图，并将序列复制到 word 文件中。
8. 从文库 1 基因组序列的第一个碱基开始连续获取 35 bp 片段，如图形摘要所示。
9. 获取 35 - bp 片段，这样这些片段将覆盖库 1 中两个 35-bp 片段之间的断点。对于 58 kb CDKN2A/B 区域，您将有 1668 个 35-库 1 和库 2 的 bp 片段。
10. 在 Excel 文件中列出每个库的 1668 个序列。
11. 通过将公共侧翼序列添加到 Excel 文件中的每个 35-bp 片段来构建库 1 和 2，如表 1所示。

表 1 Reel-seq 库的构建

12. 从商业供应商处订购库 1 和 2。
注意：您可以将这两个库作为两个子库一起订购，方法是在 5' 端添加公共序列 AGGACCGGATCAACT，在 3' 端添加 CATTGCGTGAACCGA。这些常见的序列将用作大规模平行寡核苷酸合成的接头。

B. 文库 1 和 2 的文库 DNA 分离
1. 收到文库 DNA 后，使用无 DNase 水将合成 DNA 文库重悬至终浓度为 100 ng/mL，并在 -20°C 下保存。
2. 将合成 DNA 文库稀释至1 μL库存，最终浓度为5、10、20、50、100和200 pg / μL 。
3. PCR 扩增文库 DNA，使用引物 PE_SP (L1_FP)：5' ACACGCACGATCCGACGGTAGTGT3'和 G3 (L1_RP)：5'CGAGCTTATCGTCGTCATCC3' 用于文库 1， new_SP (L2_FP)：5' GGTGTGATGCTCGGATCCAGGAAC3'和 926RR (L2_RP)：5' CACGAGACTACTGTCCTACC3' 用于库 2。
注意：这些引物是在我们的实验室中出于不同目的生成的，并且是在我们的试点 Reel-seq 筛选中测试的许多引物中选择的。这些引物都适用于 PCR，但有些不适合重复扩增子扩增，有些则不适合二代测序或文库制备。因此，请确保不要为 Reel-seq 筛选更改这些引物。
4. 进行 PCR 反应 T100 热循环仪，如表 2所示， PCR程序见表3 。

表 2。文库的PCR扩增脱氧核糖核酸

表 3. PCR 扩增程序

5. Mini-PROTEAN ® Tetra 垂直电泳槽中组装5% Mini-PROTEAN ® TBE 凝胶。
6. μL来分离所有 2 5 μL的 PCR 产物 6 × 凝胶上样染料在5% Mini -PROTEAN ® TBE 凝胶上。
7. 使用 10 μL的 1 ×低分子量DNA 梯作为标记。
8. × TBE 缓冲液在 100 V 下运行凝胶电泳约 60 分钟。
9. 拆卸凝胶盒，使凝胶仍附着在玻璃板的一侧。
10. ×覆盖凝胶表面对凝胶进行染色 GelStar在 RT 下 20 分钟。
11. BLoOK TM可视化 PCR 产物 LED Transilluminator，并从最佳扩增条带（无上条带）切割含有 79 bp 文库DNA 的条带（图 2 ）。

图 2. 库 1 (A) 和 2 (B) 的扩增。
如图所示，用不同浓度的文库 DNA 通过 PCR 扩增显示包含文库 DNA 的 79-bp 条带的 5% 丙烯酰胺凝胶。

12. 将每个切片的凝胶带（约 3 × 5 mm 大小）放入 150 μL 在微管中加入10% TE 缓冲液，并在室温下摇晃过夜。
13. 收集 ~120 μL 含有文库 DNA的液体。此时，您应该为每个含有纯化文库 DNA 的文库配备一个试管。
14. 将带盖的试管放入Thermo Scientific Savant DNA 120 SpeedVac浓缩器中，这是一种真空离心机。
15. 浓缩文库 DNA，首先打开离心机，然后打开真空。
16. 使用Implen C40 NanoPhotometer UV/Vis Spectrophotometer Mobile System将 DNA 样本标准化为 10 ng/ μL 。

C. Reel-seq 筛选文库 DNA 的制备
1. PCR 扩增从程序 B获得的文库 1 和 2 的文库 DNA。
2. 使用 5 μL纯化的文库 DNA（~10 ng/ μL ）制备表 2中配制的 PCR 反应，并根据表 3中列出的程序运行 PCR 反应，但只需要 15 个循环。
3. 将每个文库 DNA 一式三份扩增，以便您有足够的 DNA 用于 Reel-seq 筛选。
4. 运行 5 μL 如程序 B （步骤 6-10）中所述，在5% Mini-PROTEAN ® TBE 凝胶上从每个反应中提取 PCR 产物，以检查 PCR 扩增的质量。您应该观察到一个 79 bp 左右的主要条带，所有反应都具有相对相同数量的 DNA。
5. 文库 1 和 2 的扩增文库 DNA 现在已准备好用于 Reel-seq 筛选。

D. 核提取物 (NE) 的分离
1. 2的细胞培养箱中，用 ERG-2 培养基在 150 毫米板中培养 ~1.5 × 10 8人原代动脉 EC 。
2. 使用 DPBS 清洗细胞三次。
3. × Roche cOmplete迷你蛋白酶抑制剂鸡尾酒刮取5 mL DPBS 中的细胞。
4. 使用临床台式 IVD 离心机以 450 g 离心 5 分钟收集细胞。
5. 使用NE-PER TM核和细胞质提取试剂分离 NE ，但仅使用一半体积的核提取试剂 (NER) 来提取 NE。这将产生浓度为 ~10 μ g / μL的 NE 。
6. 根据制造商的说明，使用Roche cOmplete迷你蛋白酶抑制剂混合物来防止蛋白质降解。
7. 将 NE 分成 ~20 μL 等分试样，并在 -80 °C 下储存至少一年。
笔记：细胞培养条件和培养基将取决于您用于分离 NE 的细胞系。

E. 用于 EMSA 的 NE 滴定
1. 使用LightShift TM化学发光 EMSA 试剂盒进行滴定，方法是混合表 4中配制的所有试剂。

表 4. 滴定核提取物浓缩反应

2. 使用程序 C中的 5 μL文库 DNA滴定 NE，方法是添加 0、0.5、1、2 和 3 μL在程序 D中分离的 NE 。
3. 将混合物在室温孵育 2 小时或在 4°C 过夜。
4. 使用5% Mini-PROTEAN ® TBE 凝胶进行 EMSA ，每 20 μL反应混合物中加入 5 μL试剂盒中提供的 5 ×上样染料。
5. 如程序 B （步骤 6-10）中所述，在5% Mini-PROTEAN ® TBE 凝胶上运行每个反应的所有 25 μL PCR 产物，并使用BLoOK TM可视化 PCR 产物 LED 透照器。
6. 使用光密度测定法确定与对照（未添加 NE）相比，样本中的文库 DNA 发生偏移的反应，并使用 NE 的量（例如，2 μL ）进行以下 Reel-seq 筛选（图 3 ）。
笔记：如果一个 79 bp 的片段没有被清楚地观察到，你应该应用更多的循环，例如 20 个循环用于程序 C的步骤 2 中的 PCR 。

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图 3. NE 滴定。
丙烯酰胺凝胶显示使用不同量的 NE 滴定导致与对照相比，样品中约 50% 的文库 DNA 移动的 NE 量。

F. 卷轴序列屏幕
1. 根据表 5 ，使用LightShift TM化学发光 EMSA 试剂盒制备 EMSA 反应，一式三份。此时，您应该为每个库拥有三个控件和三个样本。

表 5. EMSA 反应

2. 在室温下摇动反应混合物 (300 rpm) 2 小时或在 4°C 下过夜。
3. 使用5% Mini-PROTEAN ® TBE 凝胶进行 EMSA ，每 20 μL反应混合物中加入 5 μL试剂盒中提供的 5 ×上样染料。
4. 如程序 B （步骤 6-14）中所述，从三个对照和三个样本（图 4A ）中纯化 79 bp 未移位的库 DNA 条带。
5. PCR 扩增上面获得的文库 1 和 2 的文库 DNA 。
6. 表 2的规定准备 PCR 扩增反应，并按照表 3中列出的程序运行 PCR ，但只需要 15 个循环。
7. 如程序 B （步骤 6-10）所述，在5% Mini-PROTEAN ® TBE 凝胶上运行每个反应的5 μL PCR 产物，以检查BLoOK TM的 PCR 扩增质量 LED 透照器（图 4B ）。
8. 重复程序 F十次。
笔记：
a. 您应该在所有反应中观察到一个 79 bp 左右的主要条带（每个库三个对照和三个样本），并且 DNA 量相对相同（图 4B ）。扩增的文库 DNA 现在已准备好进行下一轮 Reel-seq 筛选。
b. 此外，一般来说，对 Reel-seq 筛选应用阳性对照是一个好主意。当我们执行这个 Reel-seq 时，我们没有任何阳性对照。这是因为在我们筛选的 58-kb CDKN2A/B 区域中从未发现过 cis-RE。但是，如果可以确保这些 cis-RE 在您用于 Reel-seq 筛选的细胞中发挥作用，则始终可以使用来自人类基因组其他区域的 cis-RE 作为阳性对照。

图 4. Reel-seq 屏幕。
丙烯酰胺凝胶显示 EMSA ( A ) 和 PCR (B ) 在 Reel-seq 筛选的第 1 轮中的结果，三个缓冲液处理的对照和三个 NE 处理的样品，用于两个文库之一。

G. 使用两个 PCR 反应制备下一代测序文库
1. 从第 1、4、7 和 10 轮中选择 Reel-seq PCR 产品，以准备下一代测序库。由于每轮有3个对照和3个样本，每个文库一共会生成24个子文库。
2. 对每个对照和样品使用 1 μL的 Reel-seq PCR 产物，根据表 6 执行第一个 PCR 反应。
注意：我们使用Herculas II 融合 DNA 聚合酶，如前所述 ( Larman et al., 2013 )。
3. 根据表 7中列出的程序运行 PCR 。

表 6. 高通量测序前的 PCR 扩增

表 7. 高通量测序前的 PCR 扩增程序

4. 库 1 使用 L1/PE_SP 和 R1/G3 引物，库 2 使用 L1/new-SP 和 R1/926RR 引物。所有这些引物的序列列于表 8中。
注：我们根据二代测序的能力、Reel-seq文库中DNA片段的数量、30-50%的突变率，选择了第1、4、7、10轮的PCR产物进行测序。 Reel-seq 筛选中的 PCR 和测序成本。这四轮产生的数据足以进行统计分析。

表 8. 用于下一代测序文库制备的引物

5. 检查第一个 PCR 反应的质量，通过在 2% 琼脂糖凝胶上运行 5 μL PCR 产物和 2 μL凝胶上样染料。在所有反应中都应观察到一个相对均匀的 132 bp 条带（图 5A和B ）。

图 5. 测序文库制备。
琼脂糖凝胶显示第一次 PCR（ A和B ）和第二次 PCR（ C和D ）的 PCR 产物。 C：控制； S：样品。

6. 根据表 9执行第二个 PCR 反应，对每个对照和样品使用 2 μL的第一个 PCR 产物，并使用表 10中列出的程序运行 PCR 。

表 9. 高通量测序前的第二次 PCR 扩增反应
表 10. 高通量测序前的第二个 PCR 扩增程序

7. 对两个文库使用 L2 和 R2（条形码）引物，如表 8中所列。总共需要 48 个具有 48 个不同条形码的 R2 引物来扩增 48 个子库。
注意：L2 和 R2 引物包含接头序列 p5 和 p7（表 8 中带下划线）。适配器允许测序文库结合并在流动槽上生成簇以进行照明测序。这些带有条形码的引物的设计和序列在Kozarena和 Tuner (2011) 中进行了描述。
8. 在 2% 琼脂糖凝胶上运行 5 μL PCR 产物和 2 μL Gel Loading Dye来检查第二个 PCR 反应的质量。在所有反应中都应观察到一个相对均匀的 188 bp 条带（图 5C和D ）。
9. 根据表 11混合第二个 PCR产品。每个文库都有 186 μL的二级 PCR产物混合物。

表 11. 用于测序文库纯化的混合 PCR 产物
注意：我们根据经验选择了表 11中提到的卷。 PCR 可以产生突变，更多的突变是通过用 NE 处理的文库 DNA 进行 PCR 产生的。因此，我们使用了这些数字为每个文库获得相对均匀的测序读数（无突变）。

10. 如程序 B （步骤 6-14）中所述，对每个文库使用5% Mini -PROTEAN ® TBE 凝胶纯化混合 PCR 产物。每个 186 μL 文库 DNA 应均匀分布在 9 个孔中，其中 1 个孔用于标记。
11. 在 188-bp 处切割带，将每个切片凝胶放入 150 μL的 10% TE 缓冲液中，并通过在 RT 上摇晃过夜来隔离测序库。
12. 使用SpeedVac浓缩器将 DNA 文库浓缩至约 50 ng/ μL 。
13. 将两个测序文库发送到核心设施进行下一代测序。对库 1 使用 PE_SP 引物，对库 2 使用 new_SP 引物。
14. NextSeq 500对库 1 和 2 进行测序，单次读取高输出为 75 bp，下午 2.5点，加入1% PhiX 。
笔记：
a. 作为测序的一部分，您应该请求数据分析以列出所有 24 个子库中每个 35 bp 片段的读数，包括库 1 和库 2。下一代测序在匹兹堡大学的基因组学研究中心进行 ( https://www.genetics.pitt.edu/next-generation-sequencing )。
b. 您用于下一代测序的实际平台取决于您文库的大小。一个小的库可以通过MySeq进行测序；因此，请咨询测序专家以确定您要使用的实际测序平台。

数据分析

1. 使用 Excel 执行所有数据分析。
2. 计算 24 个子库中每个 35 bp DNA 片段的百分比。
3. 使用三个缓冲处理控件和三个 NE 处理样本中的三个百分比来计算第1、4、7和 10 轮中每个片段的学生t 检验的P值。
4. 计算第 1、4、7 和 10 轮中三个缓冲处理对照和三个 NE 处理样本中每个 DNA 片段的百分比平均值。
5. 计算第 1、4、7 和 10 轮中三个 NE 处理样本与三个缓冲处理控件的百分比平均值之比。
6. 应用这四个比率来计算第1、4、7和 10 轮中每个 35 bp DNA 片段的斜率。
7. 应用斜率< 0 作为第一个过滤器，在第1、4、7 和 10 轮中应用P < 0.05 作为第二个过滤器。
8. 在第 1、4、7 和 10 轮中将斜率< 0 和P < 0.05的片段识别为候选顺式- RE。
注意：我们已成功使用 Reel-seq 识别 200 kb 区域上的 cis-RE。但是，此时，我们还不知道 Reel-seq 可以筛选出多大的区域的限制。此外，我们估计使用 Reel-seq 识别 cis-RE 的保真度 > 90%。

食谱

1. 0. 5 × TBE 缓冲液 (1 L)
将 50 m L 的 10 × TBE 添加到 950 mL 的蒸馏水 (dH 2 O) 中。
2. 1 × 凝胶之星（10 毫升）
添加 1 μL的 10,000 × GelStar TM核酸凝胶染色剂至 10 mL dH 2 O。
3. 1 ×低分子量 DNA 梯
添加 100 μL 低分子量 DNA 梯子的 900 μL dH 2 O和 200 μL 6 × DNA 凝胶上样染料。
4. 10% TE 缓冲液
将 1 mL 的 TE 缓冲液添加到 9 mL 的 dH 2 O。
5. 2% 琼脂糖凝胶
μ g琼脂糖溶解在 100 mL 的 0.5 × TBE 中。

致谢

等人在 Nucleic Acids Research 中的原始出版物修改而来的。（2021 年）。我们感谢 NIH NIA 和 UPMC 的赠款支持。这项工作部分得到了 NIH NIA R01AG056279 (GL)、 R01AG065229 (GL)和 UPMC (GL) 的资助。

利益争夺

作者声明没有竞争的经济利益。

参考

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