材料和试剂

1.Feather ®无菌一次性手术刀，带塑料手柄的不锈钢刀片（21 号刀片）
2.缝合/手术剪（来自任何合格的供应商）
3.过滤的微量移液器吸头（蓝宝石，各种尺寸，例如10 μL 、300 μL和 1,250 μL ，Greiner，目录号：772363、738265、750265）
4.5和10 mL血清移液管（Greiner，目录号： 606 180）
5.50 mL锥形离心管（Greiner，目录号： 227261 ）
6.注射器（各种尺寸，例如，来自任何合格供应商的5 –20 mL ）
7.Millex ®一次性注射器过滤器单元，一次性 0.22 μm孔径（Merck Chemicals，目录号： SLGP033RK）
8.40μm细胞过滤器（Corning，目录号： 352340 ）
9.Dispase II（Roche，目录号 4942078001），储存于 4°C
10.组织培养板，24 孔，平底（Corning Incorporated，目录号： 3524）
11.组织培养板，6孔，平底（Corning Incorporated，目录号： 3516）
12.高葡萄糖-GlutaMAX （ GIBCO，目录号： 10566016），储存在4°C
13.胎牛血清（同一批次的 FCS 用于一系列完整的实验，以避免 FCS 成分的可变影响）
14.青霉素/链霉素溶液（来自任何合格的供应商）
15.甲醛溶液（37%）（Sigma-Aldrich，目录号：8187081000），室温储存，新鲜制备工作溶液
16.Peel-A-Way 嵌入模具，截断-T8（ Polysciences ，目录号：18985-1）
17.组织包埋和处理盒（来自任何合格的供应商）
18.Sakura Finetek TM Tissue - Tek TM OCT 化合物（ ThermoFisher Scientific，目录号：12351753）
19.第 3/6/9 号石蜡（Richard-Allan-Scientific， ThermoFisher Scientific，目录号：8335）
20.磷酸盐缓冲盐水（PBS，无菌）（来自任何合格的供应商）
21.Korsolex ® basic（BODE Chemie ，目录号：0022014）用于器械消毒
22.Wt HSV-1（格拉斯哥菌株 17+）；通过密度梯度离心（5 – 15% ficoll梯度）从感染的 BHK 细胞的上清液中纯化；通过 Vero-B4 细胞中的噬斑测定确定病毒滴度（参见Grosche 等人，2019）
23.全皮肤分离试剂盒（美天旎 biotec ，目录号：130-101-540)
24.DPX 封固剂（Sigma-Aldrich，目录号： 06522）
25.TryplE Select（GIBCO，目录号： 12563029）
26.细胞解离溶液非酶1 × （Sigma-Aldrich，目录号： C5914）
27.细胞培养基（见食谱）
28.表皮冷冻切片封闭缓冲液（参见食谱）
29.真皮和全层（全层）皮肤冷冻切片封闭缓冲液（参见食谱）
30.Dispase II 溶液（见配方）
31.Whole Mount Blocking Buffer（见配方）
32.PBS-Tween（见食谱）

设备

1.精密镊子（弯的和直的）（来自任何合格的供应商）
2.5% CO 2培养箱，设置在 37°C
3.石蜡切片机
4.低温恒温器
5.II级生物安全柜
6.通风柜
7.FACS机器（Canto II BD Biosciences）

软件

1.ImageJ-win64（开源；Schneider等人，2012）
2.FacsDIVA v6.1.3 (BD)
3.FlowJo v7.6.3 （树星）

程序

人体组织的制备和体外感染

A.总（全层）人体皮肤的制备和体外感染（图 1、2）
1.手术后直接在含有 10% FCS 和 1% 青霉素/链霉素的DMEM - 高葡萄糖 - GlutaMAX中储存和运输完整的皮肤活检。避免长时间存放。否则，将活检保存在 4°C 直至准备使用。
2.将皮肤活检置于干净的工作表面 II 级生物安全柜中并使用镊子和手术剪小心地去除皮下脂肪（图 1a）。
3.清洁脂肪和可见下面的真皮后，使用手术刀 (#21) 将完整的皮肤切成 5 × 5 毫米件（图 1b）。

图 1. (全层) 人体皮肤 (a, b) 和皮肤剃须 (c) 的制备。

4.清洗总（全层）皮肤片 3倍，并放置（每孔 1 个）在 24 孔组织培养板中进行感染。
5.的 1 mL DMEM-高葡萄糖-GlutaMAX 中使用滤嘴制备病毒悬浮液，并带有感兴趣的 MOI（我们建议使用 10–100 PFU/细胞）。病毒剂量的计算可以通过 5 × 5 mm 全层皮肤（约 2.5 × 10 5 个细胞）表面积的近似细胞计数来确定。
6.将总（全层）皮肤浸入含病毒介质（1 mL）中以进行感染。
7.在 37°C的 5% CO 2培养箱中感染所需的时间/时间点（最长 24 小时）。
8.在所需的时间点，使用过滤嘴去除病毒悬浮液，并用 PBS 清洗一次。
9.立即嵌入含有 Tissue-Tek OCT 化合物的截断 T8 Peel-A-Way 嵌入模具中，并在 -80°C 下冷冻以制备冷冻切片。
10.或者，将 3.4% 甲醛直接固定在组织培养板中，在室温下 2 小时或在 4°C 下过夜，以制备石蜡样品。
11.对于整体安装分析，请执行步骤 C3 – C8。例外：避免在 37°C 下孵育（见注 5）。

总（全层）人体皮肤的制备和体外感染。
pi比例尺 (50 μm ) 中描述的程序示意图。 (b)冷冻切片的免疫染色仅在 100 PFU/细胞感染后 16 小时在样品边缘显示受感染的 (病毒 ICP0 表达) (绿色) 细胞。胶原蛋白 VII ( colVII )（红色）描绘基底膜，DAPI（蓝色）用作核复染剂。透射光 (TL) 使皮肤样本的边缘和中间部分可视化。比例尺，50 μm 。

B.制备和体外感染（图 1、3）
1.按照上述步骤 A1 - A3。
2.使用大小至少为 15 cm 2的皮肤样本。
3.将食指周围的皮肤包裹起来以拉伸皮肤，然后使用手术刀将包括表皮在内的顶端部分和真皮的下面顶端部分剃掉。剃须约 1 毫米厚（图 1c）。
4.修剪剃成 3 × 3 毫米片。
5.继续执行 A4 – A9中描述的步骤。

图 3.剃须的制备和体外感染。
(a) 感染前 B. HE 染色切片中描述的程序的示意图。比例尺，50 μm 。 (b) 冷冻切片的免疫染色显示皮肤剃须的中间部分。透射光 (TL) 显示形态，胶原蛋白 VII ( colVII )（红色）描绘基底膜，DAPI（蓝色）用作核复染剂。比例尺，50 μm 。

C.制备和体外感染 (图 4)
1.按照上述步骤 A1 - A3。
2.将全部（全层）皮肤片放入 6 孔板中（大约10-15片可以放入一个孔中）并用 PBS洗涤 3次。
3.使用精密秤，在 50 mL 锥形离心管中称量 4 U/mL分散酶II，并通过涡旋溶解在 PBS 中。
4.准备一个新的 50 mL 离心管并使用 0.20 μm注射器过滤器对分散酶II 溶液进行过滤。
5.将每孔 2 mL 的分散酶II 溶液放入含有总皮肤片的 6 孔板中，使皮肤片漂浮在溶液中（确保表皮朝上）。
6.在 4°C 下孵育过夜。
7.用 PBS清洗分散酶II 处理的皮肤片 3 × 。
8.使用两个镊子，从皮肤的角落开始，轻轻地从真皮剥离表皮。如果遇到阻力，将样品在分散酶II 溶液中在 37°C 下再孵育 15 分钟，必要时重复（参见视频Rahn 等人，2015a）。
9.制备病毒悬浮液时，将分离的表皮样品放入24 孔组织培养板中的 1 mL PBS中。
10.的 DMEM-高葡萄糖-GlutaMAX中制备病毒悬浮液，并带有感兴趣的 MOI。病毒剂量的计算可以通过 5 × 5 mm 表皮样本（约 3 × 10 5 个细胞）的基底层的近似细胞计数来确定。
11.用含病毒介质 (1 mL) 替换含有表皮样本的井中的 PBS。表皮片应漂浮，基底面朝下。
12.在 37°C的 5% CO 2培养箱中感染所需的时间/时间点。
13.在所需的时间点，去除病毒悬浮液并用 PBS 清洗一次。
14.立即嵌入Tissue-Tek OCT 化合物中并在 -80°C 冷冻以制备冷冻切片。
15.或者，在 3.4% 甲醛中在室温下固定 2 小时或在 4°C 下过夜，以制备石蜡样品或整个安装。

图 4.分离的人表皮的制备和体外感染。
感染前 C. HE 染色切片和 24 小时pi比例尺 (25 μm ) 中所述程序的示意图。 (b) 以 100 PFU/细胞感染 6 小时后，表皮整体免疫染色可显示基底层中具有核 ICP0 点（绿色）的感染细胞和一些具有细胞质 ICP0（绿色）的细胞。冷冻切片的免疫染色显示表皮在 6 小时后具有表达 ICP0（绿色）的细胞，并且在模拟感染后没有感染细胞。 DAPI（蓝色）用作核复染剂，loricrin（lor）（红色）主要描绘颗粒层。比例尺，50 μm 。

D.制备和体外感染（图 5）
1.按照上述步骤 C1 - C8。
2.制备病毒悬浮液时，将分离的皮肤样本放入24 孔组织培养板中的 1 mL PBS中。
3.在含有 10% FCS 和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM-高葡萄糖-GlutaMAX中制备 1 mL 病毒悬浮液，并带有感兴趣的 MOI。病毒剂量的计算可以通过 5 × 5 mm 真皮（约 2 × 10 5 个细胞）表面积中的近似细胞计数来确定。
4.在 37°C的 5% CO 2培养箱中感染所需的时间/时间点。
5.在所需的时间点，去除病毒悬浮液并用 PBS 清洗一次。
6.立即嵌入Tissue-Tek OCT 化合物中，并在 -80°C 下冷冻，以制备冷冻切片或整个贴片。
7.或者，在 3.4% 甲醛中在室温下固定 2 小时或在 4°C 下过夜，以制备石蜡样品。

图 5.制备和体外感染分离人体真皮。
pi比例尺 (50 μm ) 中描述的程序示意图。 (b) 在 50 PFU/细胞感染后，冷冻切片的免疫染色在 24 小时后仅显示一些表达 ICP0 的细胞（绿色），用DAPI（蓝色）作为核复染剂。透射光 (TL) 显示形态。比例尺，50 μm 。

感染后程序
组织学分析
A.石蜡包埋组织样品的制备用于石蜡切片的苏木精和伊红 (HE) 染色
1.将组织固定在 3.4% 的甲醛中后，用 PBS 清洗样品，并储存在 70% 乙醇溶液中的组织包埋和处理盒中。
2.将所有感兴趣的样品固定并储存在 70% 乙醇溶液中后，继续将样品浸入石蜡中。
3.将样品嵌入嵌入模具中。
4.– 45°C的水浴在切片机上制备 8 µm 厚的切片。
5.在染色之前，对样品进行脱蜡并相应地染色 HE。
6.使用 DPX 安装介质嵌入带有玻璃盖玻片的样品，并允许在通风橱下过夜干燥。
7.在光学显微镜中获取 HE 染色样品的透射光图像。

感染细胞的可视化
B.免疫组织化学——冷冻切片
1.注意：冷冻样品不是固定的！
2.在 -21°C 的低温恒温器 3050 (Leica) 上制备 8 µm 厚的切片。
3.每个显微镜载玻片至少准备三个切片，每个样品至少 100 μm的距离。
早期病毒蛋白的可视化（例如，ICP0）：
4.在室温下固定在 1 – 2% 甲醛中 10 分钟。
5.用表皮冷冻切片缓冲液（用于表皮样品；参见食谱）或真皮/总皮肤阻断缓冲液（用于真皮、总皮肤和剃须样品；参见食谱）在室温下孵育冷冻切片长达 6 小时。
与目标一抗（例如， ICP0，单克隆抗体 11060；1:60；Everett等人，1993）在 4°C 下孵育过夜（De La Cruz等人，2021）。
6.清洗 3 × 5 分钟。
7.与二级抗体和 4 ',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 在 RT 中孵育 45 分钟。
8.通过用盖玻片覆盖部分嵌入Dako荧光介质。
9.在共聚焦显微镜（带 TCS-SP5 设备的 Leica DM IRBE）上获取图像。

C.免疫组织化学-整个坐骑
1.用 PBS 清洗 FA 固定的表皮整体样品。
2.参见配方 5）孵育表皮片（基底面朝下） 1 小时。
3.与感兴趣的一抗（例如， ICP0 1:60 ）在室温下孵育过夜，摇动。
4.清洗至少 4 × 45 分钟（参见配方 6）。
5.与二抗和 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 在 4°C 下孵育过夜。
6.再次清洗至少 4 × 45 分钟（见配方 6）
7.对于嵌入，将基面朝上的表皮片放在载玻片上，并通过用盖玻片覆盖表皮来嵌入Dako荧光介质。如果难以区分基部和顶端，则在安装过程中使用解剖显微镜。

D.通过流式细胞术测定受体表面表达（感染前）的细胞解离
1.Nectin-1 表面检测 - 表皮细胞：
a.将表皮片（准备参见 C）放在TrypLE Select 溶液上，在室温下放置 30 分钟。
b.用两倍体积的 DMEM 停止反应，并用镊子将细胞从组织中机械分离。
c.通过 40 μm细胞过滤器过滤细胞并用计数室计数。
2.HVEM 表面检测 – 表皮细胞：
将表皮片（制备参见 C）置于无酶解离溶液中，在室温下放置 30 分钟（参见Petermann 等人，2015）。
3.受体表面表达——真皮细胞：
a.用全皮肤分离试剂盒 ( Miltenyi ) 在 37°C 下摇动 (180 rpm) 消化真皮薄片 2.5 小时。
b.通过 40 μm细胞过滤器过滤细胞并用计数室计数。
4.抗体：
a.抗 nectin-1（单克隆抗体 CK41；1:100； Krummenacher 等。 , 2000)。用抗小鼠 IgG-Cy5 (1:100; Jackson) 观察 Nectin-1。
b.与藻红蛋白 (PE) 缀合的抗 HVEM 抗体 (CD270-PE, REA247, 1:11; Miltenyi )。

数据分析

1.由于来自不同患者和/或不同身体区域的皮肤样本之间观察到的高度差异，单个样本的数量不得少于三个。根据样本大小，最好将实验重复进行（如果有足够的样本允许，则重复三次）。
2.图像采集：
a.使用共聚焦显微镜（带 TCS-SP5 设备的 Leica DM IRBE）获取图像。
b.模拟感染样本用作染色对照。
c.查看每个样本的三个部分，并将代表性区域捕获为 z 堆栈（0.17-0.5 µm 堆栈）或部分。
3.感染效率分析：使用 ImageJ-win64 通过细胞计数或平均荧光强度测量 (MFI) 确定。为 MFI 测量分析的图像应在同一时间使用相同的显微镜设置获取。

笔记

1.与培养细胞的同步 HSV-1 感染相比，含有病毒的培养基在感染后 1 小时不更换为新鲜培养基，而是一直保持到达到结束时间点。根据皮肤厚度、其延伸或其他影响因素，病毒到达其靶细胞可能需要不同的时间。此外，组织损伤似乎先于病毒附着。因此，将样本保持在病毒悬浮液中可以使病毒在以后的时间点接触皮肤细胞。
2.我们对分离表皮的感染研究仅限于24小时，样品与真皮分离后直接感染。根据我们的经验，较长的孵育时间可能会以多种方式影响组织。这包括但不限于紧密连接复合物的重排、组织解体和细胞损失（De La Cruz等人，2021）。需要模拟感染样本来确定这些变化对 HSV-1 感染分析的贡献。为了分析毒素/细胞因子可能引起的影响，我们将完整的皮肤样本预孵育长达 3 天，然后感染 24 或 48 小时pi
3.为了关联感染的结果和组织的状态，我们总是在感染前和感染后的不同时间进行 HE染色。此外，感染前的 HE染色允许从患者材料中排除表现出异常皮肤特征（例如，太薄或太厚的表皮等）的皮肤样本，并确保我们的分析使用至少具有可比性的样本进行。
4.分散酶II 处理过夜后没有分离的情况。在这些情况下，我们建议将样品在 37°C 下孵育更长的时间。每 15 分钟检查一次，直到表皮和真皮容易分离并且感觉它们之间没有阻力。
5.为了分析总皮肤离体感染后表皮的感染模式，感染后可通过分散酶II 处理将表皮与真皮分离，并准备整个支架用于基底细胞的染色和可视化 (A11)。对于这种方法，应避免在 37°C 下与分散酶II 一起孵育，以防止感染进展。
6.此外，在冰上用 1 PFU/细胞感染表皮层 1 小时，然后在 37°C (5% CO 2 )下孵育后，可以确定病毒滴度。感染后 1 小时更新培养基，感染后 3小时收集上清液，代表输入病毒。样品再次用新鲜、温热的培养基覆盖，并在感染后 48 小时收集上清液以确定产生的病毒。可以获得额外的更长或更短的时间点；但是，必须为每个所需的时间点准备单个表皮样品（不要使用一张表皮片来获得多个时间点的上清液）。为了确定产生的病毒滴度，然后可以对收集的上清液进行传统的噬斑测定。
7.使用 3% Korsolex 60 分钟对任何可重复使用的实验室设备进行消毒。

食谱

1.细胞培养基（也用作病毒悬浮培养基）
DMEM (1 × ) + GlutaMAX辅以
10% 胎牛血清
100微克/毫升链霉素
100 U/mL 青霉素

2.表皮冷冻切片封闭缓冲液
试剂最终浓度数量
普通山羊血清5%500微升_
吐温-200.2%20 微升_
PBS (1 × )广告10 毫升

3.真皮和全层（全层）皮肤冷冻切片封闭缓冲液
试剂最终浓度数量
牛奶粉0.5%0.25 克
冷水鱼皮明胶（预热至40°C）0.25%125 微升_
海卫 X-1000.5%250微升_
普通山羊血清5%2500 µL
牛血清白蛋白 (10% w/v)0.1%500 µL
PBS广告50 毫升

4.Dispase II 溶液
× PBS中新鲜制备 4 U/mL 。
过滤灭菌溶液。

5.整装封闭缓冲液
试剂最终浓度数量
牛奶粉0.5%0.25 克
冷水鱼皮明胶（预热至40°C）0.25%125 微升_
海卫 X-1000.5%250微升_
TBS (1 × )广告50 毫升

6.PBS-吐温
试剂最终浓度数量
吐温-200.2%50微升_
PBS (1 × )广告25 毫升

致谢

这项研究由德国研究基金会 (KN536/16-3)、科隆大学科隆财富计划/医学院和 Maria- Pesch基金会资助。我们感谢 Wolfram Malter （科隆大学医院妇科）和 Max Zinser （科隆大学医院整形、重建和美容外科）提供人体皮肤样本。该协议用于我们之前发表的作品（De La Cruz 等人， 2021）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

在所有患者知情同意后获得人体皮肤标本。该研究得到了伦理委员会的批准科隆大学医学院（批准号 17-481）。

参考

1.De La Cruz, NC, Möckel , M., Wirtz, L., Sunaoglu , K., Malter , W., Zinser , M. 和Knebel-Mörsdorf , D. (2021)。单纯疱疹病毒 1 对人体皮肤的体外感染显示机械伤口作为通过皮肤表面的入口不足。病毒学杂志 95（21）：e0133821 。
2.Everett, RD, Cross, A. 和 Orr, A. (1993)。一种截短形式的单纯疱疹病毒 1 型即早蛋白 Vmw110 以细胞类型依赖性方式表达。病毒学197（2）：751-756。
3.Grosche , L.、 Döhner , K.、 Düthorn , A.、 Hickford -Martinez, A.、 Steinkasserer , A. 和Sodeik , B. (2019) 1 型单纯疱疹病毒传播、滴定和单步生长曲线。生物协议。 _ 9（23）：e3441。
4.Hukkanen , V.、 Mikola , H.、 Nykänen , M. 和Syrjänen , S. (1999)。单纯疱疹病毒 1 型感染在三维角质形成细胞培养物中有两种不同的传播方式。 J Gen Virol 80（第 8 部分）：2149-2155。
5.Krummenacher , C., Baribaud , I., Ponce de Leon, M., Whitbeck, JC, Lou, H., Cohen, GH 和 Eisenberg, RJ (2000)。通过使用抗受体单克隆抗体定位单纯疱疹病毒糖蛋白 D 在疱疹病毒进入介质 C 上的结合位点。病毒学杂志 74（23）：10863-10872 。
6.Petermann , P., Thier , K., Rahn , E., Rixon , FJ, Bloch, W., Özcelik , S., Krummenacher , C., Barron, MJ, Dixon, MJ, Scheu, S.等。（2015 年）。单纯疱疹病毒 1 进入小鼠表皮的机制：nectin-1 和疱疹病毒进入介质作为细胞受体的参与。病毒学杂志 89（1）：262-274。
7.Rahn , E., Thier , K., Petermann , P. 和Knebel-Mörsdorf , D. (2015a)。用单纯疱疹病毒 1 型体外感染小鼠表皮。 J Vis Exp (102)：e53046。
8.Rahn , E., Petermann , P., Thier , K., Bloch, W., Morgner , J., Wickström, SA 和Knebel-Mörsdorf , D. (2015b)。单纯疱疹病毒 1 型侵入小鼠表皮：离体感染研究。 J Invest Dermatol 135（12）：3009-3016。
9.Schneider, CA, Rasband , WS 和Eliceiri , KW (2012)。 NIH Image to ImageJ：25 年的图像分析。 Nat 方法9（7）：671-675。
10.Syrjänen , S.、 Mikola , H.、 Nykänen , M. 和Hukkanen , V. (1996)。在三维角质形成细胞培养中体外建立单纯疱疹病毒 1 型溶解性和非生产性感染。病毒学杂志 70（9）：6524-6528 。
11.Tajpara , P., Mildner , M., Schmidt, R., Vierhapper , M., Matiasek , J., Popow-Kraupp , T., Schuster, C. 和 Elbe- Bürger , A. (2019)。研究单纯疱疹病毒感染的临床前模型。 J Invest Dermatol 139（3）：673-682。
12.Thier , K., Petermann , P., Rahn , E., Rothamel , D., Bloch, W. 和Knebel-Mörsdorf , D. (2017)。机械屏障限制单纯疱疹病毒 1 侵入人类口腔粘膜。病毒学杂志91（22）。
13.Visalli , RJ, Courtney, RJ 和 Meyers, C. (1997)。 1 型单纯疱疹病毒在器官型上皮培养系统中的感染和复制。病毒学230（2）：236-243。
14.Wirtz, L.、 Möckel , M. 和Knebel-Mörsdorf , D. (2020)。单纯疱疹病毒 1 侵入小鼠真皮：Nectin-1 和疱疹病毒进入介质在衰老过程中作为细胞受体的作用。病毒学杂志94(5)。