材料和试剂
注意：除非另有说明，所有试剂均在室温下保存。
1. 锥形瓶（2,000 mL 和 1, 000 mL）
2. 6厘米培养皿（Genesee Scientific，目录号：32-105G）
3. 磁力搅拌棒
4. 高压灭菌胶带
5. 秀丽隐杆线虫
6. 500 mL Olympus 真空过滤瓶（Genesee Scientific，目录号：25-227）
7. 琼脂（Fisher Scientific，目录号：BP1423）
8. 双蒸水 (ddH 2 O)
9. NaCl（Fisher Scientific，目录号：S671-500）
10. 胰蛋白酶蛋白胨（Gibco，目录号：211921）
11. 胆固醇（MP Biomedicals，目录号：ICN10138201）
12. 乙醇，200-proof（ Decon Laboratories，目录号：04-355-223）
13. CaCl 2 ·2H 2 O（Fisher Scientific，目录号：C79-500）
14. MgSO 4 ·7H 2 O（Fisher Scientific，目录号：A14491）
15. KH 2 PO 4 （Fisher Chemical，目录号：P285-3）
16. NA 2 HPO 4 ·7H 2 O（Fisher Scientific，目录号：S373-500）
17. M9 最小培养基（见食谱）
18. 胆固醇原液（见食谱）
19. 1 M CaCl 2储备溶液（见配方）
20. 1 M MgSO 4储备溶液（见配方）
21. 1 M KH 2 PO 4 ，pH 6.0 储备溶液（见配方）
22. 眉毛挑毛（见食谱）
23. NGM 板（见食谱）

设备

1. Zeiss Stemi 305 立体显微镜（Zeiss，目录号：435063-9010-000）
2. 线虫培养箱(15–25°C)
3. 乙醇蜡烛（DWK Life Sciences，目录号：04-245-1）
4. 高压釜
5. pH计（热电公司）
6. Fisher Scientific等温搅拌器（Fisher Scientific，目录号：11-100-49S）
7. 巴斯德移液器（Fisher Scientific，目录号： 22-378893 ）
8. 柔软纤细的眉毛
9. 胶带
10. 第二个计数器（例如每秒发出哔声的 YouTube 视频或应用程序）
11. 铂金丝虫镐（内部制造，如沃伦伯格等人。 , 2013 )

软件

1. GraphPad Prism v8.4.3。（GraphPad 软件公司）
2. 生物渲染 ( www.biorender.com )

程序

笔记：
1. 除非另有说明，否则所有步骤均使用无菌技术在生物安全柜 (BSC) 外进行。
2. 该协议假定线虫已经在固体线虫生长培养基 (NGM) 板上培养并生长到感兴趣的年龄。
3. 用于本文提供的数据的线虫是在大肠杆菌OP50 上培养和维持的，并且与我们之前使用的方法一致（ Walker 等人，2021 年）。
4. C. _线虫大小会影响 TOP 测量值；因此，我们建议仅对成虫使用这种检测方法。此外，在测试影响蠕虫大小的条件时，实验者必须使用适当的大小匹配控件。

A. 蠕虫准备
1. 为了减少错误，使用铂丝挑将蠕虫转移到一个新的 NGM 板上，该板上播种有感兴趣的细菌。确保每个板上的蠕虫数量相等，并且每个板上的细菌数量相等，这在测试和控制蠕虫之间是一致的。
笔记：确保在样品之间点燃蠕虫挑，以避免与细菌或蠕虫菌株交叉污染。

B. 动力评估
注意：此步骤是使用解剖显微镜和滴答作响的第二个计时器执行的。
1. 使用带有眉毛的镐（图 2），将包含蠕虫的 NGM 板放在视图中。将眉毛滑到蠕虫的中部下方，计算蠕虫完全爬出所需的秒数。
注意：重要的是要确保虫子没有被眉毛刺到一边；相反，头发应该轻轻地放在蠕虫下面。此外，确保眉毛不会进入琼脂，始终位于琼脂顶部，并在琼脂表面和蠕虫之间保持静止。不要用眉毛提起虫子。
2. 记录蠕虫爬出的秒数。根据需要继续使用蠕虫和样本。

图 2. TOP 检测中使用的眉毛挑毛图。

数据分析

TOP 测定允许实验者通过测量蠕虫完全脱离眉毛所需要的秒数来评估运动性的变化。 TOP 测量与运动成正比——花费的时间越多，缺陷越大。通过比较实验组和对照组的测量结果来分析结果。我们使用各种线虫菌株来证明 TOP 测定的可行性。数据代表两个独立的实验，总共至少有 30 条蠕虫。数据表示为平均值的标准误差 (SEM)，并使用学生t检验计算统计显着性（参见图 1 中的图例）。

笔记

所有试剂都应无菌以避免样品污染。所有其他预防措施都包含在“程序”中协议的相应步骤中。

食谱

1. M9 最小中号
a. 混合 5.8 g Na 2 HPO 4 ·7H 2 O、3.0 g KH 2 PO 4 、5.0 g NaCl 和0.25 g MgSO 4 ·7H 2 O。
b. 2 O填充至 1 L。
c. 放置在搅拌板上，混合直至所有试剂溶解。
d. 过滤消毒成两个 500 mL 瓶。
e. ，分装到较小的无菌瓶中，并储存在 RT。
2. 胆固醇原液
将胆固醇溶解在 200 级乙醇中，最终浓度为 5 mg/mL 胆固醇。储存在 -20°C 直至使用。
3. 1 M CaCl 2储备溶液
a. 将 147 g CaCl 2 ·2H 2 O 添加到 1 L 烧瓶中。
b. 2 O填充至 1 L。
c. 添加磁力搅拌棒。
d. 放置在搅拌板上直到试剂溶解。
e. 等分并松散地拧在瓶子上。
f. 贴上高压灭菌胶带。
g. 高压灭菌器流体循环 30 分钟。
h. 冷却，完全拧上盖子，并储存在 RT 直到使用。
4. 1 M MgSO 4储备溶液
a. 将 246.5 g MgSO 4 ·7H 2 O 添加到 1 L 烧瓶中。
b. 2 O填充至 1 L。
c. 添加磁力搅拌棒。
d. 放置在搅拌板上直到试剂溶解。
e. 等分并将瓶盖松散地拧在瓶子上。
f. 贴上高压灭菌胶带。
g. 在 121°C 下使用流体循环高压灭菌 30 分钟。
h. 冷却，完全拧上盖子，并储存在RT 直到使用。
5. 1 M KH 2 PO 4 , pH 6.0 原液
a. 将 136.1 g KH 2 PO 4添加到 1 L 烧瓶中。
b. 溶解在 800 mL 的 ddH 2 O中。
c. 添加磁力搅拌棒。
d. 放置在搅拌板上直到试剂溶解。
e. 用 10 克 KOH 将 pH 值调节至 6.0。添加 ddH 2 O 至 1 L。
f. 试剂完全溶解后，将 pH 值调节至 6.0，分装并拧松瓶盖。
g. 贴上高压灭菌胶带。
h. 在 121°C 下使用流体循环高压灭菌 30 分钟。
i. 冷却，完全拧上盖子，并储存在 RT 直到使用。
6. 眉毛挑毛
将柔软且相对较细的眉毛放在玻璃巴斯德移液器的较小尖端中，根部优先。用胶带固定。
7. NGM 板
a. 在 2 L 烧瓶中，结合 3.0 克 NaCl、2.5 克胰蛋白酶蛋白胨和 17.0 克琼脂。
b. 将 ddH 2 O 填充至 1 L。
c. 添加磁力搅拌棒。
d. 放在搅拌板上，让试剂混合几分钟。
e. 将盖子（松散地拧上）或箔纸放在瓶子的开口上。
f. 贴上高压灭菌胶带。
g. 在 121°C 下使用流体循环高压灭菌 30 分钟。
h. 冷却至 50°C。
i. 添加 1 mL 的 5 mg/mL 胆固醇原液、1 mL 的 1 M CaCl 2原液、1 mL 的 1 M MgSO 4原液和 25 mL 的 1M KH 2 PO 4 、pH 6.0 原液。
注意：让胆固醇储备溶液 (5 mg/mL) 达到室温，并确保胆固醇在添加到 NGM 之前重新溶解在溶液中。
j. 盖上盖子并放回搅拌板上一分钟。
k. 倒入 60 mm 培养皿中。
l. 冷却并倒置在塑料盒中，盖上 4°C。

致谢

这项工作得到了美国传染病学会、美国国立卫生研究院 (R03AG070580-01) 以及佛罗里达大学食品和农业科学研究所微生物学和细胞科学系提供的启动资金的部分支持DMC。沃克等人。 (2021) 是该协议的原始研究论文。图形摘要图是使用BioRender.com创建的。

利益争夺

资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。作者宣称不存在竞争利益。

参考

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2. Winter, PB, Brielmann , RM, Timkovich , NP, Navarro, HT, Teixeira-Castro, A., Morimoto, RI 和 Amaral, LA (2016)。一种识别自由移动种群中秀丽隐杆线虫身份的网络方法。科学代表6：34859。
3. Mohri-Shiomi , A. 和Garsin , DA (2008)。胰岛素信号传导和热休克反应调节感染期间秀丽隐杆线虫肠道中的蛋白质稳态。生物化学杂志 283（1）：194-201 。
4. Morley, JF, Brignull , HR, Weyers, JJ 和 Morimoto, RI (2002)。聚谷氨酰胺扩张蛋白聚集和细胞毒性的阈值是动态的，并受秀丽隐杆线虫衰老的影响。 Proc Natl Acad Sci USA 99（16）：10417-10422。
5. Brignull , HR, Moore, FE, Tang, SJ 和 Morimoto, RI (2006)。致病阈值的聚谷氨酰胺蛋白在泛神经元秀丽隐杆线虫中表现出神经元特异性聚集模型。神经科学杂志 26（29）：7597-7606 。
6. MacLeod, AR, Waterston, RH, Fishpool , RM 和 Brenner, S. (1977)。秀丽隐杆线虫肌球蛋白重链结构基因的鉴定。分子生物学杂志114（1）：133-140。
7. Walker, AC, Bhargava, R., Vaziriyan -Sani, AS, Pourciau, C., Donahue, ET, Dove, AS, Gebhardt, MJ, Ellward , GL, Romeo, T. 和Czyz , DM (2021)。秀丽隐杆线虫肠道与人类肠道细菌病原体的定植导致蛋白质稳态破坏，丁酸盐可以挽救这种破坏。公共科学图书馆病原体17(5)：e1009510。
8. Gidalevitz , T., Ben- Zvi , A., Ho, KH, Brignull , HR 和 Morimoto, RI (2006)。聚谷氨酰胺疾病模型中细胞蛋白质折叠的逐渐破坏。科学311（5766）：1471-1474。
9. Wollenberg , AC, Visvikis , O., Alves, A.-MF 和Irazoqui , JE (2013)。秀丽隐杆线虫的金黄色葡萄球菌杀灭试验。生物协议3(19)：e916。