材料和试剂

1. 玻璃移液管（Drummond Scientific Company， MICROCAPS ® ，目录号：1-000-0500）
2. 1.5 mL微量离心管（WATSON，目录号：131-815C）
3. 50 mL管（Greiner，目录号：227261）
4. 10 mL塑料移液管（FALCON，目录号：357551）
5. 1,000 µL 移液器吸头（WATSON，目录号：110-7-6C）
6. 200 µL 移液器吸头（WATSON，目录号：110-705C）
7. 10 µL 移液器吸头（WATSON，目录号：110-207C）
8. Kimwipes（NIPPON PAPER CRECIA Co., Ltd.，目录号：62020）
9. 纸巾（ASKUL，目录号：1944368）
10. 35毫米盘子（IWAKI，目录号：1000-035）
11. 60 mm 培养皿（CORNING，目录号：351007）
12. 带针头的注射器（Terumo Corporation，带 26 号 1/2 英寸针头的 1 mL 注射器，目录号：SS-01T2613S）
13. 一次性手套（AXEL，目录号：61-7347-30）
14. C57BL/6N 和 C57BL/6J 雌性小鼠（Japan SLC, Inc.）：4-6 周龄和≥10 周龄（7-9 周龄除外，因为它们不适合超排卵）
15. eCG （ASKA Animal Health Co., Ltd.，SEROTROPIN ® ，1,000 IU × 10 瓶，目录号：无应用），4°C 储存
16. AIS plus eCG （Kyudo Co., Ltd.，CARD HyperOva ® ，1 mL，目录号：F021），-20°C 储存
17. hCG （ASKA Animal Health Co., Ltd.，Gonadotropin for animal，3,000 IU × 5 小瓶，目录号：No application），4°C 储存
18. 盐水（Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.，20 mL×50小瓶，目录号：不适用）：室温储存
19. CARD mHTF培养基（Kyudo Co.，Ltd.，2 mL，目录号：GA017），4°C保存
20. M2 培养基（Merck， EmbryoMax ® M2 Medium，目录号：MR-015-D），-20°C 储存
21. 透明质酸酶（Sigma-Aldrich，目录号：H3506-100MG），储存于-20°C
22. 液体石蜡（ Nacalai Tesque ，Inc.，特制试剂，目录号：26137-85）：室温避光，避光保存
23. 70％乙醇（Yoshida Pharmaceutical Company， Ecosyoueta消毒液，目录号：14987288980046）
24. 铝箔（AXEL，目录号：6-713-01）

设备

1. 防护设备（例如，口罩、护目镜和实验室外套）
2. CO 2培养箱（ASTEC Co., Ltd.，型号：SCA-165DS）
3. 立体显微镜（尼康，型号：SMZ645）
4. 干热灭菌器（松下，型号：MOV-212S-PJ）
5. 精密天平（AXEL，型号：1-1726-01）
6. 安瓿刀（AXEL，型号：5-124-22）
7. 酒精灯（AXEL，型号：6-487-01）
8. 移液器控制器（FALCON，型号：357469）
9. P-1000 移液器（GILSON，型号：F120602）
10. P-200 移液器（GILSON，型号：F123601）
11. 微量移液器（Eppendorf，型号：4920000024）
12. 吸管（Drummond，型号：2-040-000）
13. 过滤器（Millipore，型号：SLGPR33RS）
14. 安瓿玻璃切割机（AXEL，型号：5-124-22）
15. 大直剪（夏目制作所，型号：B-3）
16. 小直剪（夏目制作所，型号：B-12）
17. 弯头镊子（AXEL，型号：6-531-19）
18. 镊子（AXEL，型号：2-529-12）
19. 精密镊子（DUMONT，型号：NO.5-INOX）
20. 针（AXEL，型号：2-013-01）
21. 石蜡液分配器（ Nichiryo Co., Ltd.，型号：00-DP-2B）
22. 机械计数计数器（AXEL，型号：63-1584-34）
23. 塑料笼子（ Clea Japan, Inc.，型号：CL-0103-2 Mouse T PX）

软件

1. Microsoft Excel（微软公司）

程序

A. 动物
在以下特定的无病原体条件下培育C57BL /6 品系（每笼 2-4 只小鼠）：在 23 ± 1 °C 控制温度下，12 小时明暗循环（8:00 亮灯，20 点熄灯） :00)，并随意获得食物和水。

B. 心电图(7.5 IU/100 µL)的制备
1. 打开三个装有eCG粉末和两瓶生理盐水的小瓶。
2. 使用带有 1,000 µL 吸头的 P-1000 移液器向每个eCG小瓶中加入 2 mL 盐水，通过移液器混合，然后将溶液（总体积为 6 mL）转移到 50 mL 管中。
3 、重复步骤B2两次，收集所有心电图，即将心电图粉末（3,000 IU）溶解在18毫升生理盐水中。
4. 用移液器控制器和 10 mL 塑料移液管将 22 mL 生理盐水加入 50 mL 试管中，以获得心电图工作溶液，即将心电图粉末（3,000 IU）溶解在 40 mL 生理盐水中。
5. 在 1.5 mL 微量离心管中制备 1.2 mL 等分试样（每只小鼠 7.5 IU/100 µL），并在 -20 ° C下储存直至使用，最长可保存 6 个月。
6.需要时，将 eCG溶液在室温下完全解冻，并在使用前充分混合。

C. hCG的制备(7.5 IU/100 µL)
1. 打开一个装有hCG粉末和两瓶生理盐水的小瓶。
2.使用带有新的 1,000 µL 吸头的 P-1000 移液器将2 mL 生理盐水加入hCG小瓶中，通过移液器混合，然后将溶液转移到新的 50 mL 管中。
3. 重复步骤C2两次，收集所有的hCG ，即将hCG粉末（3,000 IU）溶解在6 mL生理盐水中。
4. 使用移液器控制器和新的 10 mL 塑料移液管将 34 mL 生理盐水加入 50 mL 管中，以获得hCG工作溶液，即将hCG粉末（3,000 IU）溶解在 40 mL 生理盐水中。
5.在 1.5 mL 微量离心管中制备 1.2 mL 等分试样（每只小鼠 7.5 IU/100 μL ），并在 -20°C 下储存直至使用，最长可保存 6 个月。
6.需要时，将 hCG溶液在室温下完全解冻，并在使用前充分混合。

D. 含有透明质酸酶的M2培养基的制备
1. 量取 0.5 mg 透明质酸酶并添加到新的 50 mL 试管中。
2. 解冻 M2 培养基，向含有透明质酸酶（1% 溶液）的试管中加入 50 mL。
3. 轻轻颠倒充分混合。
4. 在 1.5 mL 微量离心管中制备 1 mL 等分试样，并在 -20°C 下储存直至使用。
5. 需要时，将溶液在室温下完全解冻，并在使用前充分混合。
注意：透明质酸酶是无菌的，但未经过滤，因为该试剂是在干净的工作台上调整的。

E. 用于鸡蛋处理的玻璃移液器的制备（见视频 1）
1. 使用安瓿玻璃切割器在中间切割玻璃移液器（图 1A）。
2. 用酒精灯的火焰加热玻璃移液管的切割边缘使其光滑。
3. 用一只手握住玻璃吸管的两侧和一对 c弯头镊子。
4. 加热移液器的中部直到它稍微变软（图1B），从火焰中取出，立即将两端拉平。
5. 剪掉移液器的多余部分，加热，轻轻抚平吸头。光滑的尖端不太可能损坏鸡蛋和盘子。
6. 在立体显微镜下检查吸头（图 1C）并选择内径约为 150–200 µm 的玻璃移液器。
7. 用铝箔包裹玻璃移液器（图 1D），干热灭菌（180 °C，30 分钟），并在室温下储存在新的15 mL 管中。
注意：具有适当内径的移液器可以轻松处理鸡蛋。一次实验应准备多支玻璃移液器，操作不便时更换新移液器（例如，卵丘细胞粘附在尖端）。

视频 1. 制作玻璃移液器。
https://os.bio-protocol.org/doc/upprotocol/p4557/Abstract10_0_20220307101956355/Movie%201.mp4

图 1. 制作玻璃移液器。
(A) 切割玻璃移液器。 (B) 加热和软化玻璃吸管。插入，拉玻璃吸管。 (C) 玻璃移液器的尖端。插入，移液器吸头的放大视图。 (D) 包裹玻璃吸管。

F. 超排卵
1. 在室温下解冻 eCG或CARD HyperOva ®溶液并充分混合。
2. 用注射器吸取所需量的eCG或HyperOva ® （每只小鼠100 μL ）；例如，为 10 只雌性小鼠吸出 1 mL 的eCG或HyperOva ® （图 2A）。
3. 握住鼠标，将 100 µL eCG或HyperOva ®注入腹腔（图 2B 和 2C）。
4. 将老鼠放回笼子。
5.注射 eCG或HyperOva ®后 48 小时，注射 100 µL hCG 以相同的方式（图2A、2B和2C）。
6. 将老鼠放回笼子。
注意：错误的剂量或激素注射时间不足会减少正常排卵的卵数。

图e 2. 超排卵程序和卵子收集。
(A) 填充注射器。 (B) 雌性小鼠的腹腔注射。 (C) 超排卵试剂注射和卵子收集的时间表。 AIS，抗抑制素血清；心电图，马绒毛膜促性腺激素； hCG ，人绒毛膜促性腺激素。

G. 菜肴的准备
1. 在空的 35 mm 培养皿中加入石蜡液（图 3A 和 3B）。
2. 将四滴和六滴 CARD mHTF培养基（每滴 100 µL）放入两个 60 mm 培养皿中，并用石蜡液覆盖这些滴（图 3A、3C、3D 和 3E）。
3.在收集卵-积云复合物之前，将这些培养皿在37 °C和 5% CO 2的 CO 2培养箱中孵育至少 30 分钟（图 3F）。
4. 解冻含有透明质酸酶的 M2 培养基，将四滴（每滴 200 µL）置于新的 60 mm 培养皿中（图 3G 和 3H）。
注意：在洗鸡蛋之前准备好这个。无需用石蜡液覆盖 M2 培养基滴并将其放入 CO 2培养箱中。由于 M2 培养基是一种 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸基培养基，它可以在 CO 2培养箱外的室温下长期使用（Carter 等，1993）。

图e 3. 本实验中使用的菜肴。
(A) 分配石蜡液。 (B) 为孤立的输卵管保留盘子。 (C, E) 用于收集卵积云复合物的盘子。 (D) 洗鸡蛋的盘子。 (F) CO 2培养箱。（G，H）从鸡蛋中去除积云细胞的盘子。

H. 卵-积云复合体的集合
1. 将剪刀和镊子放在工作台上（图 4A）并戴上手套（必要时戴上其他防护设备）。
2.注射 hCG后14-16小时，处死雌性小鼠（图 2C）。
3. 用70%乙醇消毒腹部，用大剪刀剪开小鼠腹部皮肤。
4. 拉动切割皮肤的两侧并进入小鼠腹膜。
5. 用小剪刀剪开腹膜。
6. 通过移动肠道和内脏的位置来定位V形子宫、输卵管和卵巢。
7. 用一对精密镊子夹住输卵管连接处，切开子宫输卵管和峡部壶腹连接处，将输卵管与子宫分开（图 5A 和 5B）。
8. 通过去除脂肪组织、血液和组织液来清洁输卵管，并将输卵管转移到从 CO 2培养箱中移出的培养皿中。
注意：使用保存盘将收集盘的暴露时间减少到室温。
9. 将收集盘从 CO 2培养箱移到工作台上，使用一对精密镊子将输卵管转移到收集盘上的液体石蜡中，并将输卵管放在该盘的底部。
10. 在立体显微镜下（视频 2 和图 4B ）使用针头从壶腹取出卵-积云复合物，并将卵-积云复合物添加到收集盘上的一滴 CARD mHTF培养基中（图 6A 和 6B）。超排卵处理平均每只雌性小鼠诱导 20-50 个卵子（ Shindo et al ., 2021)，一滴包括 <100 个鸡蛋。
11. 将收集盘移至 CO 2培养箱。
12.对所有雌性小鼠重复步骤H2-H 11。
注意：准备与超排卵小鼠数量相对应的 CARD mHTF介质滴。

图e 4. 本实验中使用的工具。
(A) 用于腹部探查的解剖装置。 (B) 立体显微镜。用于卵-积云复合体的插入、处理装置。 (C) 用于鸡蛋转移的嘴移液装置。 (D)带有吸气介质的玻璃移液器。箭头，介质的液体表面。

图 5。卵巢、输卵管和子宫的图片。
( A)卵巢、输卵管和子宫的序列视图。每个连接点由虚线表示。 (B)输卵管的分离视图。箭头表示壶腹。

视频 2. 从壶腹中取出卵积云复合体。
https://os.bio-protocol.org/doc/upprotocol/p4557/Abstract10_0_20220307100233534/Movie%202.mp4

I. 去除卵丘细胞并计数卵子
1. 将收集和洗涤的盘子从 CO 2培养箱移到工作台上。
2. 使用口腔移液器吸出含有透明质酸酶的 M2 培养基（图 4C），并将卵-积云复合物从收集盘上的 CARD mHTF培养基滴转移到去除盘上带有透明质酸酶的 M2 培养基滴中。
注意：吸出含有透明质酸酶的 M2 培养基，直到玻璃移液器的较宽部分，以便于处理鸡蛋（图4D）。
3. 嘴移液从卵丘复合物中去除卵丘细胞，并将卵转移到洗涤盘上的 CARD mHTF介质滴中（图 6C）。
4. 在洗涤盘上的三滴 CARD mHTF培养基之间移动鸡蛋来清洗鸡蛋。
5. 重复步骤I2-I4 。
6. 使用机械计数计数器计算每滴正常鸡蛋的数量，并将结果记录在 Microsoft Excel 中。正常和异常的鸡蛋很容易通过形态来区分（图 6D 和 6E）。
注意：如果正常卵子数量减少，请检查所用溶液的有效期、超排卵时间以及小鼠的年龄是否适合超排卵。

图6.鸡蛋操作。
(A) 从壶腹中取出卵积云复合体。这一滴包含 47 个鸡蛋。 (B) 透明质酸酶处理前的卵丘复合物。 (C) 透明质酸酶处理后的鸡蛋。 (D) 正常鸡蛋。 (E) 异常鸡蛋。

数据分析

使用 Microsoft Excel（ Shindo ）执行学生t检验或 Mann-Whitney 的U检验等人，2021）。

笔记

1. 将两倍量（每只小鼠 200 μL）的超排卵试剂注射到体重为 35 克或更多的小鼠中。
2. 如果您需要计算每只老鼠的鸡蛋数量，请为每只老鼠涂抹一滴。
3. 减少鸡蛋暴露于室温的时间以避免在进行 ICSI 时降低开发效率。
4. 如有必要，用显微镜相机拍照。

确认致谢

这项工作得到了 JSPS KAKENHI（授权号：JP19K09682 和 JP19H01067）和国家儿童健康中心的部分支持。发展（2021C-27）。该协议改编自两篇原创文章（ Shindo 等人，2019 年和 2021 年）。我们要感谢意得辑 ( www.editage.com ) 的英文编辑。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

所有动物实验均按照经批准的方案进行国家儿童健康与发展研究所机构动物护理和使用委员会（实验编号，A2005-007 和 A2020-005）。

参考文献

1. 卡特，DA（1993）。为受精的单细胞小鼠卵子制备培养基。方法 Mol Biol 18：141-1 43 。
2. Shindo , M., Inui, M., Kang, W., Tamano , M., Tingwei , C., Takada, S., Hibino, T., Yoshida, M., Yoshida, K., Okada, H.,等人。（2019）。精液基因簇的缺失加强了 SVS2 在男性生育力中的关键作用。国际分子科学杂志20（18）：4557。
3. Shindo , M.、Tsumura, H.、Miyado, K.、Kang, W.、Kawano, N.、Yoshida, T.、 Fukami , M. 和 Miyado, M. (2021)。 C57BL/6N 和 C57BL/6J 小鼠亚株对超排卵的反应相似。 MicroPubl Biol 2021。
4. Takeo, T. 和Nakagata , N. (2015)。使用抑制素抗血清和马绒毛膜促性腺激素联合给药的超排卵增加了 C57BL/6 雌性小鼠的排卵卵母细胞数量。公共科学图书馆一10：e0128330 。
5. Wang, H.、Herath, CB、Xia, G.、Watanabe, G. 和 Taya, K. (2001)。施用抑制素中和抗血清后小鼠的超排卵、受精和体外胚胎发育。复制122（5）：809-816。