材料和试剂

注意：大多数产品可以被其他供应商的产品替代，但不确定是否也适用于标记的产品（*），因为我们没有测试过其他材料。
1.低结合 200 µL 吸头（TreffLab，目录号：96.11179.4.01）
2.普通吸头（Nacalai Tesque，目录号：19166-54 [10 µL]、19167-44 [200 µL]、19168-34 [1,000 µL]）
3.Violamo 一次性移液器 II（VIOLAMO，目录号：2-5237-12 [2 mL]、2-5237-03 [5 mL]、2-5237-04 [10 mL]、2-5237-05 [25 mL]）
4.冷冻管（Thermo Fisher Scientific，目录号：363401PK）
5.15-mL 离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339650）
6.50-mL 离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339652）
7.1.5 mL 管（WATSON，目录号：131-715C）
8.蛋白质 LoBind 1.5 mL 管（Eppendorf，目录号：22431081）
9.胶原蛋白 I 涂层的 60-mm 培养皿（IWAKI，目录号：4010-010）
10.胶原蛋白 I 涂层的 100-mm 培养皿（IWAKI，目录号：4020-010）
注意：可以使用其他 I 型胶原蛋白涂层产品。
11.PrimeSurface 96V 板（96 孔 V 型底板） * （Sumitomo Bakelite，目录号：MS-9096V）
12.细胞计数载玻片（Logos Biosystems，目录号：L12001）
13.载玻片76×26 mm（载玻片）（Matsunami-glass，目录号：MAS-01）
14.盖板玻璃24×60 mm（盖板玻璃）（Matsunami-glass，目录号：C024601）
15.100-mL烧瓶（IWAKI，目录号：4980FK100）
16.封口膜
17.指甲油
18.人类星形胶质细胞/条件性永生化克隆 35（HASTR/ci35 细胞） * （Furihata等人，2016；Kitamura等人，2018）
19.人脑周细胞/条件性永生化克隆 37（HBPC/ci37 细胞） * （Umehara等人，2018）
20.人脑微血管内皮细胞/条件性永生化克隆 18（HBMEC/ci18 细胞） * （Kamiichi等人，2012；Ito等人，2019）
21.Blasticidin S （InvivoGen，目录号：ant-bl-1）
22.星形胶质细胞培养基试剂盒（由基础培养基和培养添加剂组成） * （Thermo Fisher Scientific，目录号：A1261301）
23.周细胞培养基试剂盒（由基础培养基和培养补充剂组成） * （ScienCell，目录号：1201）
24.VascuLife VEGF Comp 试剂盒（由 VascuLife BM 和培养补充剂组成）（Lifeline Cell Technology，目录号：LEC-LL0003）
注意：可以使用 EBM-2（Lonza，目录号：CC-3162）代替。
25.青霉素-链霉素（Nacalai Tesque，目录号：26253-84）
26.Bambanker（NIPPON Genetics，目录号：CS-02-001）
27.Dulbecco 's磷酸盐缓冲盐水 Ca、Mg 游离（D-PBS(-)）（Nacalai Tesque，目录号：14249-24）
28.D-PBS（+）制备试剂（Ca，Mg溶液）（Nacalai Tesque，目录号：02492-94）
29.汉克斯平衡盐溶液（HBSS（+ ））（Nacalai Tesque，目录号：09735-75）
30.2.5 g/L-胰蛋白酶/1 mmol/L-EDTA（胰蛋白酶）（Nacalai Tesque，目录号：32777-15）
31.台盼蓝（Wako，目录号：207-17081）
32.4％多聚甲醛（PFA）（Nacalai Tesque，目录号：09154-85）
33.Fluoro-KEEPER Antifade Reagent，Non-Hardening Type（antifade reagent）（Nacalai Tesque，目录号：12593-64）
34.甲基纤维素-粘度：4,000 cP（甲基纤维素） * （Sigma-Aldrich，目录号：M0512-100G）
35.MEM189 [Alexa Fluor 647]（Novus Biologicals，目录号：NB500-493AF647）
36.CellTracker Orange CMTMR 染料（Invitrogen，目录号：C2927）
37.红色荧光细胞质膜染色试剂盒（PromoKine，目录号：PK-CA707-30023）
38.CellTracker Green CMFDA Dye（Invitrogen，目录号：C2925）
39.AM（星形胶质细胞培养基）（见食谱）
40.P M（周细胞培养基）（见食谱）
41.VascuLife 培养基（见食谱）
42.球体培养基（见配方）
43.D-PBS(+)（见食谱）

设备

1.洁净工作台（或安全柜）
2.水浴设置在 37 °C
3.水浴设置在 60 °C
4.离心机（例如，Kokusan，目录号：H-19Rα）
5.吸气器
6.相差显微镜（例如., Nikon, ECLIPSE Ts2）
7.共焦激光扫描显微镜（例如，OLYMPUS、FLUOVIEW FV3000）
8.加湿培养箱设置为 33 °C，含 5% CO 2 /95% 空气
9.加湿培养箱设置为 37 °C，含 5% CO 2 /95% 空气
10.自动细胞计数器（例如，Logos Biosystems，目录号：L10001SS）
11.冰箱 (4 °C) 和冰柜（-20 °C 和 -80 °C）
12.液氮储存
13.电动移液器（例如，Greiner Bio-One，目录号：J847050）
14.移液器（例如，HTL LAB SOLUTIONS，目录号：7904）
15.搅拌棒（例如，AS ONE Corporation，目录号：1-4206-27）
16.电磁搅拌机
17.高压灭菌器（例如., HIRAYAMA, HV-2LB）

程序

HASTR/ci35、HBPC/ci37 和 HBMEC/ci18 细胞系携带两个永生化基因：温度敏感的猿病毒 40 大肿瘤抗原 (tsSV40T) 和人类端粒酶逆转录酶催化亚基 (hTERT) 基因。 tsSV40T 在 33 °C 时促进增殖，而在 37 °C 时变得不稳定而失去其功能。因此，为了维持和分化目的，细胞应分别在 33°C 和 37°C 下培养。详情请参阅我们之前的报告（ Kamiichi等人，2012；Furihata等人，2016；Kitamura等人，2018；Umehara等人，2018；Ito等人，2019 ）。

A.解冻细胞
笔记：
a.应始终将杀稻瘟菌素 S（终浓度 (fc) 4 µg/mL）添加到每种培养基中以维持永生化基因的表达。
b.细胞处理程序应始终在洁净工作台内进行。
1.HASTR/ci35 细胞
a.加热 a strocyte 培养基（AM，见配方 1 )在设定为37°C的水浴中。
b.将 1 mL 的 AM 添加到 15 mL 离心管中。
c.从液氮中取出含有冷冻细胞的冷冻管，并立即将其置于 37°C 的水浴中。
注意：建议将处于对数生长期（70% – 80% 汇合度）的细胞（0.5 × 10 6 – 1.0 × 10 6 ）与 1 mL Bambanker 一起冷冻保存。
d.通过在水浴中轻轻摇动冷冻管，立即开始解冻冷冻细胞。但是，在冷冻细胞完全解冻之前，将冷冻管从水浴中取出。
e.将细胞转移到含有 1 mL AM 的 15 mL 离心管中，然后在室温下离心 (120 × g ) 3 分钟。
f.使用吸气器去除上清液，并用 5 mL 的 AM 重新悬浮细胞。
g.将细胞接种到涂有胶原蛋白 I 的 60 毫米培养皿中，然后来回和左右轻轻摇晃培养皿，以确保细胞均匀分散。
h.在显微镜下检查培养皿中的细胞。
i.2 /95% 空气在 33°C 的加湿培养箱中培养细胞。
2.HBPC/ci37 细胞
HBPC/ci37 细胞的处理程序与 HASTR/ci35 细胞的处理程序基本相同，除了使用周细胞培养基（PM，参见配方2 ）而不是 AM。
注意：对于冷冻储存，我们建议在装有 1 mL Bambanker 的冷冻管中使用0.7 × 10 6 – 1.0 × 10 6的细胞数。
3.HBMEC/ci18 细胞
HBMEC/ci18 细胞的处理程序与 HASTR/ci35 细胞的处理程序基本相同，除了使用 VascuLife 培养基（见配方3 ）而不是 AM。
注意：对于冷冻储存，我们建议在装有 1 mL Bambanker 的冷冻管中使用0.8 × 10 6 – 1.0 × 10 6的细胞数。

B.传代细胞

图 1. 人类永生化 BBB 细胞在传代前后的细胞汇合。
在胶原蛋白 I 包被的 100 毫米培养皿中达到适当的细胞汇合度 (>90%) 后，如(A) 、 (B)和(C)中所示，HASTR/ci35、HBPC/ci37 和 HBMEC/ci18 细胞可分别用 6.0 × 10 5 、5.5 × 10 5和 5.5 × 10 5细胞传代。 (D) 、 (E)和(F)中显示了传代一天后捕获的代表性细胞培养图像。这些图像是在相差显微镜（ECLIPSE Ts2，NIKON，Tokyo，Japan）下拍摄的。

备注：
a.* 避免在低细胞密度水平下进行培养（应始终将融合度保持在 50% 以上）。
b.* 避免粗暴移液，以防止细胞退化或细胞特性丧失。
c.* 应始终将杀稻瘟菌素 S (fc 4 µg/mL) 添加到每种培养基中以维持永生化基因的表达。
d.以上所有注释（标有*）都非常重要。
e.细胞处理程序应始终在洁净工作台内进行。
f.例如，本节中显示的程序用于将细胞从胶原蛋白 I 涂层的 100 毫米培养皿中传代到新培养皿中。

1.HASTR/ci35 细胞
a.在 37°C 的水浴中加热 AM 和 D-PBS(-)。
b.在胶原蛋白 I 涂层盘中制备细胞，如图 1A 所示。
c.使用吸气器从盘子中取出 AM。
d.– 8 mL 的 D-PBS(-)清洗细胞一次。
e.使用抽吸器完全去除 D-PBS(-) 后，向细胞中加入 1 mL 胰蛋白酶（培养基体积的十分之一），然后在 37°C 下孵育 5 分钟。
f.在显微镜下检查细胞以确保它们已从培养皿中分离出来。
g.在细胞中加入 1 mL 的 AM（相同量的胰蛋白酶）以停止胰蛋白酶化过程，同时通过温和的移液松开任何粘附的细胞块。
笔记：
i.推荐使用 1,000 µL 吸头进行细胞移液。每次抽吸/排放操作至少需要 3 秒，以避免对电池施加过大的压力。
ii.或者，可以使用离心去除胰蛋白酶。
h.将适当数量的细胞转移到新的胶原蛋白 I 涂层 100 毫米培养皿中，然后添加高达 10 mL 的新鲜 AM。
注意：不要在100-mm 培养皿中以低于 6.0 × 10 5 个细胞的密度进行继代培养。
i.轻轻地前后左右摇晃培养皿，以确保细胞均匀分散。
j.2 /5% 空气在 33°C 的加湿培养箱中培养细胞。
在 100 毫米培养皿中使用 6.0 × 10 5 个细胞的密度时，可以每三天进行一次传代（图 1D）。
2.HBPC/ci37 细胞
在胶原蛋白 I 涂层盘中制备细胞，如图 1B 所示。 HBPC/ci37 细胞的处理程序与 HASTR/ci35 细胞的处理程序基本相同，除了分别使用 PM 和 6 分钟胰蛋白酶消化时间而不是 AM 和 5 分钟。
笔记：
a.在 100 毫米培养皿中使用 5.5 × 10 5 个细胞的密度时，可以每四天进行一次传代（图 1E）。不要以低于此浓度的密度对细胞进行继代培养。
b.即使遵循此处描述的胰蛋白酶处理方法，HBPC/ci37 细胞有时也难以从 I 型胶原蛋白涂层培养皿中分离出来。在这种情况下，请尝试以下操作之一：
1) 将胰蛋白酶处理时间延长至 9 分钟。
2) 第一次胰蛋白酶处理 6 分钟后，从培养皿中收集分离的细胞并将其转移到 15 mL 离心管中。立即向盘子中加入另外 1 mL 的胰蛋白酶溶液，再静置 3 分钟。然后，收集剩余的单元格并将它们与之前删除的单元格结合起来。
3.HBMEC/ci18 细胞
在胶原蛋白 I 涂层盘中制备细胞，如图 1C 所示。 HBMEC/ci18 细胞的处理程序与 HASTR/ci35 细胞的处理程序基本相同，除了分别使用 VascuLife 培养基和 6 分钟胰蛋白酶化时间而不是 AM 和 5 分钟。
笔记：
a.在 100 毫米培养皿中使用 5.5 × 10 5 个细胞的密度时，可以每四天进行一次传代（图 1F）。不要以低于此浓度的密度对细胞进行继代培养。
b.即使遵循此处描述的胰蛋白酶处理方法，HBMEC/ci18 细胞通常也难以从胶原蛋白 I 涂层培养皿中分离出来。在这种情况下，请按照 HBPC/ci37 细胞注释中提供的说明进行操作。

C.在 96 孔 V 型底板中构建hiMCS-BBB 模型

图 2. hiMCS-BBB 模型构建过程示意图。
此图显示在第 0 天以 1,750（细胞/孔）接种在PrimeSurface 96V 板（Sumitomo Bakelite，东京，日本）中的 HASTR/ci35 细胞。在第 1 天，将 HBPC/ci37 细胞（500/孔）添加到 HASTR 上/ci35 球体核心。在第 2 天，将 HBMEC/ci18 细胞 (750/孔) 进一步添加到每个孔中。最后，第 4 天培养的球体可用于感兴趣的化验。

笔记：
a.细胞处理程序应始终在洁净工作台内进行。
b.在 Sphroid 培养基中不需要杀稻瘟菌素 S（参见配方 4）。
c.所有培养基和 D-PBS(-) 应在 37 °C 的水浴中预热。
d.在 96 孔 V 型底板的每个孔中只能形成一个球体。
e.此处描述的球体开发协议与我们2022 年的报告有关（Kitamura 等人，2022 年）。

第 0 天：HASTR/ci35 细胞接种
1.– B1g中所示的相同程序从培养皿中收集 HASTR/ci35 细胞，并将它们转移到 15 mL 离心管中。
2.在室温下离心 (500 × g ) 管 3 分钟。
3.使用吸气器去除上清液，并用 1 mL 的 D-PBS(-) 重新悬浮细胞。
4.重复步骤 2。
5.使用吸气器去除上清液，并用 1 mL 的球体培养基重新悬浮细胞。
6.在 1.5 mL 管中将 20 μL 的细胞悬浮液与 20 μL 的台盼蓝混合。
7.将 10 μL 的台盼蓝混合细胞悬浮液应用于细胞计数幻灯片，并使用自动细胞计数器计算细胞数。
8.制备 3.5 × 10 4 个细胞/mL（用于 1，750 个细胞/50 μL/孔）的细胞悬浮液。（制备量应根据所需的孔数计算。）
9.将 50 μL 的细胞悬浮液播种到 96 孔 V 底板的每个孔中。
注意：不要使用最外层的孔，因为这些孔中的介质容易蒸发。
10.在 96 孔 V 底板的每个最外层孔中加入100-200 μL 的 D-PBS( - )。
注意：此步骤对于防止介质蒸发很重要。
11.将 96 孔 V 型底板置于 37 °C 的加湿培养箱中，温度为 5% CO 2 /95% 空气。
注意：将出现一个球体。

第 1 天：HBPC/ci37 细胞接种
12.HBPC/ci37 细胞的接种程序与上述步骤 1-9 和 11 基本相同，只是接种的细胞浓度应设置为 1.0 × 10 4 个细胞/mL（500 个细胞/50 µL/孔））。
注意：细胞悬液可以直接添加到存在 HASTR/ci35 细胞的孔中。介质变化并不总是必要的。

第 2 天：HBMEC/ci18 细胞接种
13.HBMEC/ci18 细胞的播种程序与上述步骤 1-9 基本相同，只是播种的细胞浓度应设置为 1.5 × 10 4 个细胞/mL（750 个细胞/50 μL/孔）。
注意：细胞悬液可以直接添加到存在 HASTR/ci35 和 HBPC/ci37 细胞的孔中。介质变化并不总是必要的。
14.将 96 孔 V 型底板置于 37°C 的加湿培养箱中，温度为 5% CO 2 /95% 空气，孵育 48 小时。
/ ci18 细胞播种后，球体可以在培养中至少保持48-72 小时。在培养期间并不总是需要更换培养基，但可以根据您感兴趣的分析进行。

注意：进行细胞定位分析时，HASTR/ci35、HBPC/ci37 和 HBMEC/ci18 细胞可以用适当的物质染色 [例如，CellTracker Orange CMTMR Dye (541/565 nm)、红色荧光细胞质膜染色试剂盒 ( 644/665 nm) 和 CellTracker Green CMFDA Dye (492/517 nm)，分别如图 3 所示。在每种情况下，请遵循为每种产品提供的原始协议。

图 3. hiMCS-BBB 模型中人类永生化 BBB 细胞的定位。
这些图像是在共聚焦激光扫描显微镜（FLUOVIEW FV3000，OLYMPUS，东京，日本）下捕获的，显示了 hiMCS-BBB 模型中 HASTR/ci35、HBPC/ci37 和 HBMEC/ci18 细胞的定位。 HASTR/ci35 细胞聚集在模型的内部核心，HBPC/ci37 细胞在其上形成一层。在球体的最外侧，HBMEC/ci18 细胞创建了一个充当 BBB 的层。比例尺表示 100 µm。

D.渗透性测定
笔记：
a.应不间断地执行一系列测定程序。
b.使用Alexa Fluor 647 标记的 MEM189 抗体 (MEM189)进行渗透性测定的程序如下所示。下划线部分可以根据感兴趣的物质进行适当更改（参见表 1）。
c.每当转移球体时，轻轻地将尖端垂直放入井底或管子以吸起球体。始终使用距离较薄侧顶部约 7 mm 处切割的尖端，使入口孔的直径约为 1 mm，以防止损坏球体。

表 1. 我们的渗透性测定中使用的实验条件总结
基板_最终浓度孵化
MEM189/13E410 微克/毫升180 分钟
路西法黄5微米90 分钟
2-NBDG100微米90 分钟
罗丹明1231微米90 分钟
胰岛素100纳米120 分钟
转铁蛋白100纳米120 分钟
SLS肽/DNP肽10微米60 分钟
详情请参考我们之前的论文（Kitamura et al. , 2021, 2022）。

1.使用低结合 200 µL 吸头，将 10 – 20 个球体从 96 孔 V 型底板转移到 Protein LoBind 1.5 mL 管中。
2.使用移液器小心地去除多余的上清液，直到剩下大约 15 μL 的中等体积。然后，让管子在球体完全沉入底部之前站立（图 4A）。
3.用 500 μL 的 HBSS(+) 清洗球体。
4.使用移液器小心取出上清液。然后将含有MEM189 (fc 10 µg/mL ) 的HBSS(+) 添加到试管中，直到达到大约 100 µL 的最终总体积。
5.将管水平放置以分散球体后，在 37°C 下孵育180 分钟或在 4°C 下冷藏（图 4B）。
6.如步骤 2 和 3 所述，用 500 μL 的冰冷 D-PBS(+)（参见配方5 ）清洗球体两次。
7.使用移液器小心去除上清液后，在室温下用 500 μL 的 4% PFA 孵育球体 10 分钟（固定处理）。
8.如步骤 2 和 3 所述，用 500 μL 的冰冷 D-PBS(+) 清洗球体两次。
9.使用低结合 200 μL 尖端，将球体与剩余的 D-PBS(+)（约 10-20 μL）一起从管中吸出。
10.将一块封口膜（其中一侧的 6-8 毫米正方形已被移除）放在载玻片上。空白区域是为球体提供一个受保护的空间，以尽量减少损坏（图 4C）。

图 4.“D.渗透性测定”。
图像(A)表示在步骤 2 之后剩余在蛋白质LoBind 1.5 mL 管中的上清液量 (约 15 µL)。图像(B)显示了水平放置在桌子上以分散球体的蛋白质 LoBind 1.5 mL 管的位置在步骤 5 中。图像(C)显示了一个载玻片示例，其顶部是一块封口膜，方形窗口切出用于容纳抗褪色球体混合物，如步骤 10 和 11。

11.在载玻片安装的封口膜片中的空正方形中心放置一滴抗褪色试剂后，将球体与抗褪色试剂混合，并通过轻轻移液将它们分散到开口中。
12.将盖玻片放在载玻片顶部并用指甲油密封。
注意：为防止损坏球体，请避免将盖玻璃压得太紧。
13.通过在共聚焦显微镜下观察球体立即检测荧光（ 650/665 nm，如果使用 Alexa Fluor 647 标记的 MEM189 ）（图 5）。

图 5. 抗转铁蛋白受体抗体 MEM189 的渗透性测定。
这些图像显示了使用 Alexa Fluor 647 标记的 MEM189（MEM189，10 μg/mL）及其同种型对照 IgG（CTRL IgG，10 μg/mL）在 37°C（RMT 活性条件下）进行的渗透性测定的代表性结果) 或 4 °C（RMT 非活动状态）。空白视图显示没有任何抗体孵育的球体。比例尺表示 100 µm。还显示了进入球体的 MEM189 的概述。

食谱

注意：此处准备的所有完整介质在使用前应储存在 4 °C。请遵循每个供应商提供的存储指南。

1.AM（星形胶质细胞培养基）
a.添加 N-2 补充剂和 FBS，它们包含在星形胶质细胞培养基中试剂盒，添加到基础星形胶质细胞培养基中。
b.将 1% (v/v) 的青霉素-链霉素（如Nacalai Tesque，如材料部分第 25 号所示）加入上述制备的培养基中。
2.PM（周细胞培养基）
添加周细胞培养基中包含的 FBS、PGS 和 P/S 溶液试剂盒，至基础周细胞培养基。
3.VascuLife 培养基
a.添加 rh FGF-b、抗坏血酸、氢化可的松、FBS、L-谷氨酰胺、rh IGF-1、rh EGF、rh VEGF 和肝素，所有这些都包含在VascuLife VEGF Comp 试剂盒中。
b.将 1% (v/v) 的青霉素-链霉素（如Nacalai Tesque，如第 25 号材料部分所示）添加到上述制备的培养基中。
注：虽然我们不常规使用，但也可以使用培养基供应商提供的庆大霉素-两性霉素。
4.球体培养基
a.在 100 mL 烧瓶中加入 1.2 g 甲基纤维素（粘度：4,000 cP）和搅拌棒后，在高压釜中对烧瓶进行消毒。
b.将 100 mL 的 VascuLife 培养基添加到上述消毒的 100 mL 烧瓶中。
c.将烧瓶在 60°C 的水浴中孵育 20 分钟。
d.通过在烧瓶中旋转搅拌棒一小时完全溶解甲基纤维素。
e.将 100 mL 的甲基纤维素溶液等分到两个 50 mL 离心管中。
f.将两管在室温下离心 (2,500 × g ) 30 分钟。
g.将上清液转移到无菌容器中。该溶液称为甲基纤维素原液。
h.通过将甲基纤维素库存溶液与 VascuLife 介质以 1:24 的比例混合来制备含有 0.48 mg/mL 甲基纤维素的球体介质。
注意：为确保球体具有良好的重现性，请尽可能使用新制备的球体介质。如果球体培养基超过三周，则不应使用。要创建额外的 Spheroid 培养基供应，请按照上述从步骤 h 开始的程序。
5.D-PBS(+)
将 D-PBS(+) 制备试剂 (Ca、Mg 溶液) [1%(v/v)] 添加到 D-PBS(-)。

致谢

这项工作得到了 JSPS KAKENHI (19K07214, 22Kxxxxx)、卫材（日本东京）、小野制药（日本大阪）、持田医学和药物研究纪念基金会（日本东京）的资助，部分由 AMED 资助授权号JP17be0304322h0001。作者谨向小森孝文博士（卫材）、Saki Izumi 博士（卫材）、Yoshiyuki Yamaura 博士（小野制药）和 Ryo Ito 博士（小野制药）表示衷心的感谢。该协议本质上源自 Kitamura等人。（2022 年）。

利益争夺

致谢部分提供了与研究基金相关的利益冲突声明，本文的模型开发方法已申请专利（No. 2020-007041）。还有一个相关的专利申请（No. 2020-065670）。作者声明他们没有任何其他利益冲突。

参考

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