材料和试剂

材料

1. 6孔透明平底TC处理的多孔细胞培养板（Gibco，目录号：353046）
2. 100 mm TC处理的细胞培养皿（Corning，Falcon，目录号：353003）
3. 150 mm Nunc EasYDish培养皿（ Thermo ，目录号：150468）
4. T75 TC烧瓶（Greiner Cell STAR T75，目录号：658170）
5. 15 mL离心管，锥形底部无菌（Corning，Falcon，目录号：352099）
6. 低温小瓶，1.2 mL（Corning，目录号：430487）
7. 1.5 mL 管（Sarstedt，目录号：72.690.301）
8. Pyrex 克隆筒（Corning，目录号：3166-10）
9. 移液器吸头 10 – 200 µL（Greiner bio-one，目录号：GB775362）
10. 微量移液器（ Thermo Scientific ， Finnpipette F1，目录号：GJ06928）
11. 通用永久性记号笔（Schneider，目录号：Maxx 222）
12. Artis Tweezer（Sigma，目录号：18072ARS）

试剂

1. 0.05％胰蛋白酶-EDTA（PAN Biotech，目录号：P10-040100）
2. 嘌呤霉素（ Invivo Gen，目录号：ant-pr-1）
3. Turbofect ®转染试剂（ Thermo Scientific，目录号：R0531）
4. DMEM（1 × ，Gibco，目录号：31885-023）
5. 二甲基亚砜（DMSO； Thermo Scientific，目录号：85190）
6. 不含Ca和Mg的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（Sigma，目录号：D8537-500ML）
7. pSp-Cas9（BB）-2A-Puro（PX459）V2.0 质粒（ Addgene ，目录号：62988）
8. SIRT1 gRNA (CAACAGGTTGCGGGAATCCAA) (Sigma；Oligo: 8815731198-000040)
9. Tissue-Tek ® OCT 化合物（Sakura，目录号：4583）
10. 蛋白质测定染料浓缩物（ Biorad ，目录号 5000006）
11. 抗 SIRT1 抗体（Cell Signaling，目录号：9475S）
12. 抗β-肌动蛋白抗体（Cell Signaling，目录号：8457S）
13. 缀合的抗兔IgG HRP（Cell Signaling，目录号：7074）
14. 血细胞计数器（Sigma，目录号：Z359629）
15. 青霉素/链霉素（Pan Biotech，目录号：P06-07100）
16. 胎牛血清（FBS），热灭活（Gibco，目录号：A38401-02）
17. L-谷氨酰胺（Pan Biotech，目录号：P04-80100）
18. 蛋白酶抑制剂混合物100 × （细胞信号，目录号：5871）
19. 质粒制备试剂盒（Qiagen，目录号：12362）
20. 甘氨酸（Sigma，目录号：G8898）
21. Tris-Base（ Trizma ；Sigma，目录号：T1503）
22. EDTA（ Acros ，目录号：147850010）
23. Tween-20（Sigma，目录号：P9416）
24. 甘油（霍尼韦尔，目录号：15523）
25. 十二烷基硫酸钠（SDS；Bio-Rad，目录号：161-0302）
26. 溴酚蓝（BPB；Merck，目录号：1.08122.0005）
27. 二硫苏糖醇（DTT；Sigma，目录号：D9779）
28. β-巯基乙醇（β-ME；Sigma，目录号：M3148）
29. Mini-Protean TGX 凝胶（Bio-Rad，目录号：4561094）
30. 颜色预染蛋白标准标记物（Cell Signaling，目录号：P7719S）

解决方案和媒体

Tris-甘氨酸 SDS-PAGE 电泳缓冲液 (5 × )（参见配方）
裂解缓冲液（参见配方）
基础细胞培养基（见配方）
细胞冷冻培养基（见食谱）
5 × SDS PAGE上样染料或 Laemmli缓冲液（参见配方）

设备

1. TC培养箱（ Binder，型号：CB 170，目录号：9640-0009）
2. 冷冻台式离心机（Sigma，型号：3-18KS，转子编号：11133）
3. 冷冻微量离心机（Eppendorf，型号：5430 R，转子编号：FA-45-30-11）
4. 超低温冰箱（ Thermo Scientific，目录号：TSX60086D ）
5. 液氮储存（Wharton，型号：K 系列）
6. 复合显微镜（ Wiovert ，Hund Wetzlar ，目录号：008.0309.0）

程序

原则：本协议基于两个原则；第一个利用用于基因操作（表达或删除所需基因）的细胞的固有增殖潜力。第二个原则依赖于在质粒骨架中选择功能性耐药基因的可用性。这两个原则将结合起来，快速轻松地生成可靠稳定的单细胞衍生克隆。
描述生成稳定细胞克隆的分步方法的详细程序包括五个 (A-E) 部分：
( A ) 细胞的制备和实验前装置的设计
(二)转染
( C ) 细胞的选择和回收
( D ) 菌落选择，然后在克隆筒中进行微量胰蛋白酶消化
( E ) 基因表达或基因编辑测试

开始之前：准备并储存足够数量的所需试剂、培养基、细胞培养皿或板，以用于计划的工作。此外，使用质粒制备试剂盒制备稳定克隆（如 CRISPR 或荧光标记蛋白表达质粒或其他）所需的研究质粒（参见材料和试剂部分）。

A. 细胞的制备和实验前装置的设计

在这个准备阶段，计划如下的实验前设置：
1. 从液氮罐中取出一小瓶所需的细胞，并将它们放在 15 mL 的基础细胞培养基中的 T75 培养瓶中，通常用于维护这些细胞。如果细胞已经在培养中，则将一瓶 T75 培养瓶中的健康、生长良好的细胞放在一边。通常，0.5 × 10 5 –1 × 10 5 个细胞足以完成此步骤。
2. 在 TC 培养箱中培养这些细胞，根据所用细胞的需要进行调整。对于 Hela/U2OS 细胞，我们使用保持在 37 °C、5% CO 2和 90–95% 相对湿度 (RH) 的 TC 培养箱。
3. 当培养物达到 75–80% 融合时，吸出上清液并用 10–15 mL 不含钙/镁的 PBS (1 × ) 冲洗细胞。对细胞进行胰蛋白酶处理以获得单细胞悬浮液以进行重新播种。
4. 将细胞播种在 6 孔板中，因此第二天它们的融合度约为 70–75%。大约 0.8 × 10 5 –2.4 × 10 5细胞对大多数细胞都非常有效。通常，我们为每次转染接种一个细胞孔，并为阴性对照接种一个额外的孔。
注意：如果所用细胞类型的杀伤曲线（通过将细胞与杀死细胞所需的浓度增加的选择药物孵育2-5天获得）对于所需的选择标记未知，则一式三份播种 6 个泳道(6 × 3 孔) 的 96 孔板。首先，在该板的每个孔中播种大约 0.5 × 10 4 – 1.2 × 10 4 个细胞。先前描述了有关杀灭曲线准备的更多细节（ Delrue等人，2018 年）。
5. 在 TC 培养箱中培养细胞，如步骤 A2 所示，或在实验细胞所需的基础生长条件下。

B. 细胞的转染和选择

在这一部分中，我们将用所需的质粒转染细胞，这些质粒旨在表达基因或用于序列特异性基因组编辑（如 CRISPR）或其他需要的。为此，我们建议遵循以下步骤：
1. 用新鲜培养基（2 mL/孔）更换 6 孔板的每个孔中的培养基。
2. 准备转染组合，如表所示（表 1）。

表格1。制备用于细胞转染的转染混合物。
转染细胞/孔所需的成分
混合 A（质粒或 DNA 部分） Mix B（转染试剂部分）
DMEM* 200–(X) µL DMEM* 200–A µL
所需质粒 0.5–2 µg (X µL) Turbofect试剂一微升（6微升）
混合 A 的总体积 200 µL 混合 B 的总体积 200 µL
现在混合混合A 和混合 B，并在 25 °C 下孵育 15 分钟
总体积：200 µL + 200 µL = 400 µL
* 此 DMEM 不含 FBS 或任何抗生素。

笔记：
a. 该方案使用Turbofect ®转染试剂（水中的阳离子聚合物，与 DNA 形成紧密、稳定的复合物）。尽管如此，任何其他适用于 DNA 转染的转染试剂都可以用于转染。在这种情况下，请遵循替代转染试剂制造商建议的参数。
b. Turbofect ®转染试剂成功地测试了 Hela、U2OS、NIH-3T3、HEK293 和 A549 细胞的这些条件（如表 1 所述）。然而，对于其他细胞，需要定义产生最大转染效率和最小毒性的条件。

3. 孵育后，将转染混合物以逐滴（总共 400 μL/孔）的方式转移到每个孔中。在添加转染混合物之前不要从细胞中去除生长培养基。将板放回 TC 培养箱中。
4. 转染 6 小时后，将培养基更换为新鲜的基底细胞培养基（每孔 2.0 mL），并将其放回 TC 培养箱中。

C. 细胞的选择和回收

这部分提供了从非转染细胞中选择转染细胞的详细信息。考虑到用于转染的质粒中抗生素抗性基因的固有特性，可以利用这些（例如新霉素、嘌呤霉素或其他）来选择转染细胞。为此，我们建议遵循以下步骤：
1. Replace the culture medium from each well of the 6-well plate with fresh medium containing an appropriate selection agent.不要忘记将含有选择剂的培养基添加到未转染（阴性）对照中。例如，我们的目标是使用包含嘌呤霉素基因的 CRISPR-Cas9 载体骨架作为真核生物，使用 CRISPR-Cas9 系统（载体和 gRNA 序列的详细信息在方法部分提供）生成纯合 SIRT1 -/- Hela 细胞选择标记。因此，在这种情况下，我们使用浓度为 1.0 μg /mL 的嘌呤霉素（由我们的 Hela 细胞原液的杀伤曲线确定；请参阅步骤 A4）。如上所述在 TC 培养箱中重新培养细胞。
注意：使用嘌呤霉素进行较短选择主要将 CRISPR 质粒作为附加体载体进行繁殖。然而，使用嘌呤霉素进行更长时间的选择将选择与该质粒稳定整合的细胞。尽管较短或较长的选择不会影响所需的基因操作（CRISPR介导的基因组编辑）。我们建议将抗生素选择保持更长的时间，因为稳定整合的质粒可以用作这些细胞中的工具（在交叉污染的情况下）。
2. Replace the used medium ( and also the dead cells) with fresh medium containing the appropriate selection agent as utilized in Step C1, every 48 h.在此期间，跟踪未转染的井（阴性对照）。在 3-5 天内，所有未转染的细胞都会死亡。这表明选择代理正在工作。在此阶段将丢弃阴性对照孔。继续选择转染细胞一周。此外，人们可以观察更长时间的选择以保持正压或防止整合主链的异染色质。这确保了所需基因的连续表达。
3. 胰蛋白酶消化选择后存活的转染细胞。将每口井中的细胞重新播种到两个培养皿中（15 厘米，每个板中分别约 40–100 个细胞）（图 1），其中含有约 20 mL 的培养基，其中包含步骤 C1 中描述的选择剂。

图 1. 选择、胰蛋白酶消化和重新播种。
示意图显示了在新鲜细胞培养皿 (15 cm) 中的药物选择、胰蛋白酶化和细胞重新接种。

4. 在 TC 培养箱中培养细胞，让它们形成单独的菌落。每 4天更换一次培养基并保留选择。单个细胞会形成独立的菌落，这些菌落的大小会随着时间的推移而增长。复式显微镜可用于确定菌落生长的进展。
5. 大约 10 天后，肉眼或多或少可以看到菌落（图 2），尤其是在深色背景下检查时。但是，使用复合显微镜进行简要分析总是有帮助的。

图 2. 菌落的选择和标记。
A.示意图显示了选择 10-14 天后菌落的外观。单个菌落在细胞培养皿的外底表面用实验室标记笔标记，如绿色曲线所示。太近的菌落（红色矩形）保持未选中状态。 B.在细胞培养皿上重新播种 13 天后 Hela 细胞的代表性复合显微镜图像。

6. 使用板底部的实验室标记标记单个菌落，而无需移除培养基。为了保持选择的纯洁性，不应选择彼此非常接近的菌落。
注意：通常，当使用 40 或 100 个细胞时，菌落彼此分离良好。然而，有些菌落有可能来自 2 个不同的细胞；在 E 部分描述的表征过程中可以区分此类克隆。
7. 总共标记 12-36 个菌落。可以标记更多的菌落；然而，指定的数字足以获得几个稳定的单细胞衍生克隆。将标记的细胞培养皿转移回 TC 培养箱。

代表性数据 C 部分：本部分介绍了我们最近使用基于 CRISPR-Cas9 的基因组编辑生成的 Hela 细胞系的数据。重新接种约 13 天后，细胞在最初的嘌呤霉素 (1 μg /mL) 选择期间存活。可见菌落如图 2B 所示。大约 8-10 天后，菌落开始变得可见。

D. 在克隆筒中进行菌落选择，然后进行微量胰蛋白酶消化
在这一部分中，我们将选择的菌落转移到 6 孔板的孔中。这一步很关键。因此，它需要注意力和速度。
1. 将以下物品放在干净的 TC 层流罩中，这样它们就在触手可及的地方，不会搬出或浪费任何时间。排列顺序如表2所示。

表 2. 将克隆转移到母板和复制板的项目排列顺序。
S.不。项目名称评论
1 克隆圆筒* 将它们放在新鲜的无菌盘中
2 钳子无菌的、弯曲的更适合盛放气瓶
3 预热胰蛋白酶 0.05% (w/v)；足够的音量
4 移液器吸头盒充足、无菌； 1–200 μL微量移液器吸头
5 微量移液器范围 20–200 μL
6 6 孔板（无菌）
母板孔可标记为 1P、2P、3P 等
复制板孔可标记为 1C、2C、3C等。
* 以非无菌方式提供的克隆气瓶；这些可以通过将它们放置/浸入充满水的玻璃烧杯中进行消毒，然后进行高压灭菌。

2. 从先前标记的细胞培养皿（步骤 C6）中取出细胞培养基，用 PBS（1 × ；不含 CaCl 2和 MgCl 2 ）轻轻冲洗菌落；此后，取出 PBS。
3. 使用无菌镊子，取出克隆圆筒并将其直接放在标记的菌落周围，使菌落位于圆筒的中心。为了最大限度地减少对细胞的压力，请快速工作！
4. 对培养皿上的其他菌落重复步骤（步骤 D3）；执行此操作时，请确保不要移动已固定的克隆圆筒。一个标准的 15 cm 培养皿可容纳 30–50 个分离良好的克隆柱；但是，开始时通常使用 20-30 个气缸就足够了。
5. 完成克隆圆柱体的放置后，使用Tissuetek瓶并在所有克隆圆柱体周围分配足够的这种介质，不要触摸或移动它们（图 3 和视频 1）。必须注意不要将 Tissue- tek 掉入气缸内。 Tissue - tek是一种粘性、粘性、高密度液体；因此，无需任何时间来固定克隆圆筒。

图 3. Tissuetek介导的克隆柱固定。
A.快照显示名为 Tissue-Tek ®的包埋液瓶。 B.图示通过用 Tissue - tek （黄色）围绕圆柱体进行克隆固定。

视频 1. 放置克隆筒并用 Tissue -tek固定。

6. 添加 100 μL的预热胰蛋白酶 (0.05%) 以填充每个克隆圆柱体的腔体 (图 4)。将培养皿盖的背面放在一边，放置 2-4 分钟（在 TC 层流罩中）。在此孵化期间，开始平行排列父级和复制 6 孔板（图 5）。
注意：父板和复制板的概念类似于细菌复制电镀的概念。复制板将用于初始表征，然后将从母板中扩增选定数量的所需克隆。

图 4. 克隆圆筒中菌落的微胰蛋白酶化。
图示显示在菌落胰蛋白酶化之前或期间被 Tissue- tek （黄色）包围的克隆圆柱体。胰蛋白酶显示为红色。

图 5. 在父板和复制板中播种细胞。
A. 6 孔板的标记模式。 B.示意图显示了将细胞悬液从克隆圆筒转移到亲本或复制板的指定孔中。

7. 孵育 2-4 分钟后，使用显微镜验证细胞是否已从表面分离。密切监测 2-3 个菌落就足够了。
8. μL微量移液器反复吹打混合胰蛋白酶处理的细胞悬液（通常为 2-3 次，以形成均匀的细胞混合物），然后将细胞悬液从克隆筒转移至 6 孔母体（约 30 μL ）和复制（大约 70 μL ）板。这将确保转移足够的细胞，同时防止克隆的意外混淆。对所有其他气缸重复此操作，一个接一个。继续在抗生素选择下维持母板。但是，为了确保稳定的克隆选择，复制板可以在此阶段不进行选择。
注意：确保正确标记（P1、P2……和 C1、C2…….）等孔。此外，确保您将细胞悬液准确地转移到母体和相应的副本中，没有任何错误。
9. 将板转移到 TC 培养箱并按照步骤 A2 中的说明进行维护。
10. 每隔一天更换一次用尽的介质。
11. 大多数复制板孔将在 3-5 天内汇合。这些细胞可以收获并在 -80 °C 下冷冻一段合适的时间，或直接进行 E 部分。
12. 继续监测母板的生长情况。一旦这些孔汇合，将它们胰蛋白酶化并在冷冻介质中适当标记的冷冻管中冷冻（参见食谱）。

代表性数据 D 部分：为了生成SIRT1 -/- Hela 细胞，将克隆圆柱体放置在分离良好的菌落上。在确保所需数量的克隆圆柱体之后，通过在这些圆柱体外部添加 Tissuetek来固定这些圆柱体（图 6A）。固定这些圆柱体后，使用预热的胰蛋白酶将细胞从克隆圆柱体包围的菌落中分离出来（图 6B）。

图 6. 克隆圆柱体围绕 Hela 细胞集落。
A.显示围绕 Hela 细胞集落的固定克隆圆柱体的代表性图像。 B.代表性图像显示了固定化克隆圆筒中菌落的胰蛋白酶化。

E. 基因表达或基因编辑测试

可以对收获的细胞进行处理以分析结果，例如基于 CRISPR 的敲除或任何因子的稳定表达。这部分将使用免疫印迹来确定是否达到了预期的结果。为此，可以遵循以下步骤：
1. 将细胞沉淀重悬于冰冷的裂解缓冲液中（请参阅配方部分），并添加蛋白酶抑制剂，最终浓度为 1 × 。
2. 在冰上孵育管子 20 分钟，以完全裂解收获的细胞。
3. 在 4 °C下以 14,000 rpm（ 20、800 rcf ）将管离心 15 分钟。
4. 将裂解物的上清液收集在预先标记的试管中进行免疫印迹。同时，从未转染的对照细胞中制备裂解物，用于比较表达模式。
5. 量化这些裂解物的总蛋白质含量。
注意：此方法使用蛋白质测定染料浓缩物作为蛋白质定量试剂。然而，其他蛋白质定量方法或试剂可以量化总蛋白质含量。
6. μg的总裂解物加载并运行 SDS-PAGE，并使用适当的抗体对其进行分析以获得所需的表达模式。
注意：关于 SDS-PAGE 的详细方案可在以下参考文献中找到（ Al- Tubuly ，2000； Hellewell ，2017 ）。

数据分析

我们选择了 14 个菌落并分析了它们的 SIRT1 表达。所提到的 SIRT1 gRNA 是针对人类 SIRT1 基因的外显子 1 的。因此，预计在纯合克隆中完全不存在 SIRT1 蛋白。类似地，预计杂合克隆会降低 SIRT1 的表达。在对拷贝集落进行免疫印迹后，我们观察到集落编号 2、3、5、8、9 和 11 是SIRT1 -/- Hela 细胞，而集落编号 1、4、6、7、10、12、13 和14 个来自SIRT1 +/-或SIRT1 +/- 细胞（图 7）。

图 7. Hela 细胞基因组编辑克隆的免疫印迹。
代表性免疫印迹显示在野生型（对照）或 gSIRT1 编辑的 Hela 克隆（菌落 1 至 14）的裂解物中检测到的 SIRT1 条带。蓝色虚线代表两个独立但同时进行的免疫印迹。 β-肌动蛋白用作上样对照。

食谱

1. Tris-甘氨酸 SDS-PAGE 电泳缓冲液 (5 × )

试剂最终浓度数量
三碱基 125 毫米 15.1 克
甘氨酸 1.25 万 94 克
安全数据表 0.5% 5克
H 2 O 不适用至 1,000 毫升

2. 裂解缓冲液（在 4 °C 下储存长达 1 个月）

试剂最终浓度数量
氯化钠 (5 M) 150 毫米 3 毫升
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) 50毫米 5 毫升
EDTA（0.5 M，pH 8.0） 5毫米 1毫升
NP-40 (IGEPAL CA-630) 1% 1毫升
脱氧胆酸钠 (10%) 0.5% 5 毫升
烷基硫酸钠(SDS; 10%) 0.1% 1毫升
H 2 O 不适用至 1,000 毫升
保持冰冷。使用前，用蛋白酶抑制剂混合物 (100 × )补充 (1 × )。

3. 基础细胞培养基（4°C 保存长达 4 个月）

试剂最终浓度数量
DMEM（1 克/升 D-葡萄糖） 1 × 440 毫升
胎牛血清 10% 50 毫升
青霉素/链霉素 (100 × ) 1 × 5 毫升
L-谷氨酰胺 (100 × ) 1 × 5 毫升
全部的不适用 500 毫升
使用前预热至 37 °C。

4. 细胞冷冻培养基

试剂最终浓度数量
基础细胞培养基 80% 8 毫升
胎牛血清 10% 1毫升
二甲基亚砜 10% 1毫升

5. 5 × SDS PAGE 上样染料或Laemmli缓冲液

试剂最终浓度
Tris-Cl 缓冲液 (pH 6.8) 250 毫米
10% (w/v)
0.5% (w/v)
50% (v/v)
100 毫米
SDS（电泳级）
溴酚蓝
甘油
DTT 或 β-ME
注意：缺少硫醇试剂的上样缓冲液可在室温下保存。在使用前从 1 M (DTT) 或 14 M (β-ME) 库存中添加硫醇试剂。

致谢

这项研究得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1118 & GRK 1874-DIAMICOM) 的支持。我们感谢我们小组的所有成员和 ALMF/EMBL 的支持。该协议的建立是为了生成以下出版物中使用的克隆： Kumar 等人。（2017），库马尔等人。（2020 年），Madhavan 等人。（2021a）和 Madhavan 等人（2021）。

利益争夺

作者声明没有竞争的经济利益。信函和材料请求应发送至 VK（ varun.kumar@med.uni-heidelberg.de或varun.kumar@embl.de ）。

参考

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