材料和试剂

1. 移液器吸头（USA Scientific，TipOne，目录号：1111-3700）
2. GAC/抑制剂晶体（室温）

设备

1. 镊子（ Fisher Scientific，目录号：09-753-50 ）
2. 微型工具组（ Hampton Research，目录号：HR4-811 ）
3. 移液器（Rainin，目录号：17008649）
4. 光学显微镜（奥林巴斯）
5. 六角键
6. 晶体学样品支架 (MiTeGen)
a. 样品装载箱：湿度控制，包括光学显微镜
b. 样品装载站：连接到真空泵（由脚踏板控制）用于样品吸液
c. 样品支架：包括一个包含支撑膜的框架和一个测角仪底座
d. 样品聚酯薄膜密封件

软件

1. XDS 包 ( https://xds.mr.mpg.de )
2. CCP4 程序套件 ( https://www.ccp4.ac.uk )
3. 过滤程序cut_XDS和运行它的脚本cut_XS.csh ( https://www.chess.cornell.edu/macchess/mx/mx_software )

程序

A. GAC/抑制剂晶体的处理和装载（图 2）
所有晶体均在室温下使用悬滴蒸汽扩散法在 24 孔板中生长。晶体在湿度受控的环境中处理，以帮助防止晶体脱水。
1. 通过将框架插入测角仪底座并用六角扳手拧紧来组装样品支架。
2. 从晶体托盘的一个井中取出含有 GAC 晶体的盖玻片。
3. 在显微镜下并使用微型工具，拿起晶体并将它们放在样品支架的薄膜上。薄膜的景观使晶体能够以随机方向沉淀，从而最大限度地收集数据。如有必要，用良好的溶液预润湿薄膜。晶体可以位于胶片上的任何位置。
4. 在薄膜上出现 20 个或更多晶体（尺寸为 100 × 100 × 100 μ M 3 ）后，将样品支架转移到装载盒中并放置在样品装载台上。
5. 通过光学范围查看，使用脚踏板控制的真空吸走样品薄膜上的多余液体。
6. 去除样品框架（两侧）周围的白色覆盖物，露出粘合垫圈。
7. 在框架的两侧涂上 Mylar 密封膜以覆盖并保护晶体免受干燥。
8. 包含晶体的完整样品支架现在可以安装在光束线槽中并暴露在 X 射线下。

图 2. 串行室温晶体学样品处理系统。
(A) 样品支架包含安装在测角仪底座中的矩形框架内的薄膜。框架被一个由白色覆盖物保护的粘性垫圈包围。 (B)包含光学显微镜的湿度控制样品装载盒。 (C) 连接到真空泵以进行液体芯吸的样品装载站。 (D) 样品支架薄膜上的 GAC 晶体。

B. 数据收集和处理
数据是在康奈尔大学的康奈尔高能同步加速器源 (CHESS) 上的光束线 ID7B2 (FlexX) 上收集的。
1. 包含 GAC 晶体的样品支架安装在测角仪上的光束线槽中，并以 20 μm 的步长进行光栅扫描，记录每个位置的 5 °振荡。
2. 光栅扫描的每一步在 0.75-0.5 秒内完成，数据采集时间为 0.25 秒（25 帧、0.2 °和 10 毫秒/帧），对应于 1.3 赫兹的光栅速率。
3. 使用 XDS 处理单个振荡框架集（处理表明 GAC 以斜方晶和单斜晶形式结晶。总体而言，单斜晶形式为 GAC 产生了最佳数据质量。我们通过基于晶胞尺寸过滤数据来选择该多晶型物和 XDS 中的角度并重新处理数据集）。
4. 然后使用 XSCALE（XDS 软件包的一部分）对数据进行缩放。
5. 通过过滤方法去除彼此不一致的数据集。
6. 对于 GAC，数据根据每个 25 帧集与整个集的一致性进行过滤以提供支持，使用脚本 (cut_XS.csh) 删除差异集（使用程序 cut_XDS）并重新缩放（使用 XSCALE）。单个集合之间强度的 R 因子和所有集合的平均值用于过滤差异数据。
7. 然后使用 gedit 等文本编辑器组合来自不同样本支持的已接受 25 帧集的列表，为 XSCALE 生成控制文件。
8. 然后将 XSCALE 与此控制文件一起使用以重新缩放组合数据以生成合并数据集。
9. 合并的数据集可以进一步过滤，如在步骤 6 中，使用定义差异数据的参数（R 因子）的各种值。过滤数据集以达到令人满意的数据完整性和统计值。
10. 使用 CCP4 程序无意义、无目的和 ctruncate，然后将合并的数据集转换为 mtz 文件用于结构确定。

致谢

这项工作得到了对 RAC (GM122575, CA201402)、LAM [匹兹堡大学医学中心竞争性医学研究基金 (CMRF)] 和 CHEXS (DMR-1829070) 和 MacCHESS (P30GM126166) 的资助。我们还感谢 MiTeGen 为系列室温 X 射线晶体学实验提供关键资源。该协议的部分内容改编自先前描述的方法（ Illava 等人，2021；Milano 等人，2022 ）。

利益争夺

作者声明他们与本文的内容没有利益冲突。

参考

1. Huang, Q.、Stalnecker, C.、Zhang, C.、McDermott, LA、Iyer, P.、O'Neill, J.、Reimer, S.、Cerione, RA 和 Katt, WP (2018)。强效变构抑制剂与谷氨酰胺酶 C 相互作用的表征，谷氨酰胺酶 C 是癌细胞谷氨酰胺代谢的关键酶。生物化学杂志 293（10）：3535-3545 。
2. Milano，SK，Huang，Q.，Nguyen，TT，Ramachandran，S.，Finke，A.，Kriksunov，I.，Schuller，DJ，Szebenyi，DM，Arenholz，E.，McDermott，LA，等。（2022 年）。使用连续室温晶体学对癌细胞中谷氨酰胺酶 C 抑制剂分子机制的新见解。生物化学杂志 298（2）：101535 。
3. Wierman, JL, Pare-Labrosse, O., Sarracini, A., Besaw, JE, Cook, MJ, Oghbaey, S., Daoud, H., Mehrabi, P., Kriksunov, I., Kuo, A., et人。（2019）。室温下的固定目标串行振荡晶体学。 IUCrJ 6（第 2 部分）：305-316。
4. Illava, G., Jayne, R., Finke, AD, Closs, D., Zeng, W., Milano, SK, Huang, Q., Kriksunov, I., Sidorenko, P., Wise, FW, 等。（2021 年）。用于固定目标串行同步加速器晶体学的集成样品处理和安装系统。 Acta Crystallogr D 结构生物学77（Pt 5）：628-644。