材料和试剂

1. 医用 NF 级氮气，200 号钢瓶，CGA-580（Airgas，NI NF200）。避光存放在通风良好的地方；无限期保质期。
2. 碱石灰，指示（Thermo Fisher Scientific，目录号：AA4478636 ）。常温保存；无限期储存在密闭容器中（至少 3 年）。每次暴露时使用新鲜的碱石灰。
3. 水凝胶（透明 H 2 O，70-01-5022）。常温保存；一旦打开，储存在密封的塑料袋中，一周后或干燥后丢弃。
4. 实验室啮齿动物饮食 5015 颗粒（Lab Diet，目录号：001328）。在气候受控的条件下在室温下储存；保质期至少九个月。
5. Nalgene VERSI-DRY 实验室桌子浸泡器（VWR，目录号：52857-104）。常温保存；无限期保质期。
6. VWR 一次性培养皿，10 厘米，半堆叠（VWR，目录号：25384-088）。常温保存；无限期保质期。
7. 酒精 70%（乙醇），4 L（Millipore Sigma，目录号：65350-85）。常温存放于易燃柜内；如果保持密封避光，将持续多年。
8. 胚胎第 17.5 天的 C57BL/6NCrl 小鼠用于该方案（查尔斯河）
a. 我们还成功地使用了 C57BL6/J（杰克逊实验室）动物。
b. 我们尚未测试其他妊娠时间点的暴露，但相信该协议可以根据实验需要进行调整。

设备

1. ProOx 360 多功能高输注速率 O 2控制器，带氧传感器（Biospherix，型号：E702）
2. Harris 型号 425-200-580 重型氩气、氦气和氮气单级调节器，CGA-580（Airgas，型号：HCL3000773）
3. 带立管平台的动物笼罩（ Biospherix ，A-Chamber）
4. 半透明塑料箱（用于在缺氧环境下饲养动物） [例如，BINO 塑料储物箱，深大，The Handler Collection（亚马逊，12093-CLR）]
5. 或类似的隔板（在一个房间内进行两次低氧暴露时在视觉上将动物分开）[例如， Dexas superboard 糕点板，14 英寸× 17 英寸（亚马逊，B000063SRL）]

程序

A. 氧传感器校准
1. 根据制造商的说明（使用低氧控制参数）每月校准一次氧传感器。
2. 必要时更换氧传感器（即，如果校准不成功，按制造商）。

B. 鼠标外壳设置
1. 取出一个塑料箱并用 70% 乙醇清洁。
2. 在布上用水擦拭，然后用干布擦拭。
3. 将塑料箱的底部与实验室桌浸水器排成一行（闪亮的一面朝下）。
4. 将 10–15 个 Lab Diet 5015 颗粒和 1/4 的水凝胶杯内容物放入 10 厘米培养皿中。
5. 将培养皿放在塑料箱的右后角（见图 1 ）。

图 1. 鼠标外壳设置。
显示用于缺氧室的鼠标外壳的适当设置。先前用 70% 乙醇清洁过的塑料箱内衬有 VERSI-DRY 实验室桌子浸泡液。一个 10 厘米的培养皿中装满了几个食物颗粒和 1/4 的水凝胶杯内容物，并放置在右后角。

C. 商会设置
1. 将鼠标外壳放在缺氧室的右后角（参见图 2A ）。
如果在同一个腔室中进行两次曝光，请将切菜板放在第一个鼠标外壳的左侧，然后将第二个鼠标封盖放在切菜板的左侧，以防止鼠标互相看到。
2. 在一个 10 厘米的培养皿中加入大量新鲜的苏打石灰（约 15 克）。
a. 每次暴露时使用新鲜的碱石灰，以最大限度地提高其吸收能力。
b. 可能积聚在密封室中的呼出二氧化碳 (CO 2 )。
c. 我们在同一个房间里为两只老鼠使用了同样数量的苏打石灰。

图 2.缺氧室设置。
A. 进行一次曝光时，适当设置缺氧室。外壳设置放置在腔室的右后角。将大量的苏打石灰添加到培养皿中，培养皿放置在房间的地板上（用红色箭头表示）。 B. 进行两次曝光时，适当设置缺氧室。外壳设置并排放置在腔室的后壁上。一个大切菜板放置在房间之间，以防止老鼠互相看到。将大量的苏打石灰添加到培养皿中，该培养皿放置在房间的地板上。 C.当进行两次曝光时，缩小了缺氧室的适当设置视图，氧气控制器位于室顶部。 D. 氧气控制器。突出显示的是用于调节吸入氧气水平的按钮 (1) 和用于打开流向腔室的开关 (2)。如图所示，腔室当前设置为室内空气，21%。

D. 驯化
1. 将鼠标放在缺氧室内准备好的外壳中。
2. 关闭并密封缺氧室的门。
3. 让鼠标在外壳内自由漫游 1 分钟。

E. 常氧控制（如果执行缺氧，跳到 F 部分）
1. 确保缺氧室正确关闭和密封。
2. 确保 ProOx 360 控制器已通电。如果是这样，它将显示当前的百分比吸入氧，也称为吸入氧分数 (FiO 2 )，在腔室中（应约为 21%）。
3. 确保传感器右侧的开关设置为“OFF”，而不是“GAS”。
如果只进行常氧，则无需打开气罐；如果同时进行常氧和缺氧，则气罐将打开。如果选择“OFF”，则没有氮气流向腔室。
4. 为所需的常氧暴露持续时间启动计时器。
5. 在所需的曝光时间后，继续进行 L 部分。

F. 开始缺氧暴露
1. 打开氮气罐，使用调节器右侧的仪表观察剩余的 kPa 氮气（参见图 3 ）。
2需要大约 3,000 kPa ；如果在两个腔室中进行缺氧，则需要大约 6,000 kPa。

图 3. 气体调节器刻度盘。
右侧刻度盘 (1) 是入口压力表，以 kPa 为单位显示罐中剩余的氮气量。左侧刻度盘 (2) 是输送压力表，显示流量，在暴露期间应保持在 15 到 20 psi 之间。

2. 确保ProOx 360 控制器已打开（如果打开，它将显示腔室中当前的 FiO 2百分比；它应该约为 21%）。
3. 确保传感器右侧的开关设置为“OFF”，而不是“GAS ”。
4. 设置初始 FiO 2 按住FiO 2读数下标有“ * ”的最左侧按钮，使用“ ▼ ”和“ ▲ ”按钮导航到所需值，然后松开所有按钮。
a. 在将开关从“OFF”转到“GAS”之前，将 FiO 2设定值更改为 19%。
b. 按住“*”按钮可随时检查当前的 FiO 2设定值。
5. 同时启动计时器（正数）并将开关从“OFF”转到“GAS ”。
a. 氮气将开始流动：
i. 如果听到响亮、尖锐的呜呜声，请拧紧调节器和氮气罐之间的连接。
ii. 如果管道与碳罐连接良好，当控制器使用氮气调节 O 2水平时，会发出低沉的间歇性嘶嘶声。
b. 在前 2 分钟内，检查调节器左侧仪表的流量；它应该在 15 到 20 psi 之间（参见图 3 ）。
i. 如果流速太高，逆时针转动金色控制杆来降低流速。
ii. 如果流速太低，请顺时针转动金色控制杆来增加流速。

G. 将氧气从 21% 滴定到 5%
1. 在表 1中给出的时间点，按住FiO 2读数下方标有“ * ”的最左侧按钮，将 FiO 2设定值更改为相应的值，使用“ ▼ ”导航到所需值，然后松开两个按钮。
2. 关于不同的 FiO 2设定点和实际的 FiO 2读数，请参阅注释。

表 1.预期 FiO 2的时间设定值。

H. 在 5% 时达到稳态 FiO 2
1. 前 30 分钟暴露后，室内的 FiO 2将在 5% 左右。
FiO 2读数通常在任何方向波动约 0.2%，即从4.8%到5.2%；任何大于设定点 0.2% 的波动都意味着应重新校准 ProOx 360 控制器，或者应按照制造商的说明检查缺氧室。
2. 可视化室内的鼠标，确保它在呼吸。
a. 呼吸会显得浅而快。
b. 在暴露期间，老鼠通常会选择在培养皿附近或在培养皿中睡觉，表现出最小的运动。
3. 再停留 10 分钟，确保设备正常工作，流速在 15 到 20 psi 之间，并且 FiO 2值保持恒定（在设定值的 0.2% 以内）。

I. 在曝光期间检查鼠标
1. 曝光约 4 小时后，检查鼠标，确保它仍在呼吸。
2. 检查流速是否在 15 和 20 psi 之间（参见图 3 ），并且 FiO 2读数保持恒定（在设定值的 0.2% 以内）。

J. 在曝光期间更换氮气罐
1. 如有必要，可在曝光期间更换新的氮气罐。
a. 尽可能避免。当罐在一个腔室等于或低于 3,000 kPa 和两个腔室为 6,000 kPa 时，在暴露前更换碳罐。
b. 如果在暴露过程中更换滤毒罐，请勿打开缺氧室；如果快速更换滤罐，FiO 2值将保持相对恒定。
2. 快速更换氮气罐，将调节器移至新罐。
该过程不应超过3-4 分钟。
3. 更换罐后，等待氮气流入腔室。
根据需要调整流速，使其介于 15 和 20 psi 之间（参见图 3 ）。

K. 结束缺氧暴露
1. 当达到所需的暴露时间时，立即打开缺氧室的门，让空气涌入。
2. 从腔室中取出鼠标外壳并将其放在附近的表面上。
3. 关闭ProOx 360 控制器并完全关闭氮气罐。

L. 打扫干净
1. 从外壳中取出鼠标并将其放入干净的新笼子中。
a. 清洁时定期观察鼠标，以确保其恢复良好。
i. 含氧量正常的老鼠会警觉并四处走动。
ii. 缺氧的老鼠会很冷，行动迟缓；它会在5分钟内恢复。
b. 从鼠标外壳中取出所有材料并丢弃。
c. 用 70% 乙醇清洁鼠标外壳。
d. 扔掉苏打石灰。
如果碱石灰过紫，则清除大量CO 2 ；检查缺氧室是否有问题，并在下一次暴露时添加更多的碱石灰。

笔记

如 ProOx 360 手册所述，氧传感器已针对低氧控制进行了校准。因此，在接近暴露开始时较高的 FiO 2设定点，当接近下一个设定点时，实际的 FiO 2读数低于设定点是正常的和预期的。设定点和实际 O 2读数的这种差异将随着设定点的降低而正常化；实际 FiO 2读数在较低值下接近设定值。因此，在 5% 吸入氧气的设定点，实际氧气读数将在大约 4.8%–5.2% 的范围内保持稳定。

致谢

该协议的开发得到了美国国立卫生研究院 (Grant: K08NS119797-01A1、5K12HD043245-18 、R01MH092535、R01MH092535-S1 和 U54HD086984) 以及费城儿童医院的机构资助，包括神经病学 Black Tie Tailgate Fund 、Foerderer Grant 和 K-readiness Pilot 奖。

利益争夺

作者没有竞争利益要披露。

伦理

涉及动物的研究得到费城儿童医院机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准（批准号：IAC 22-000547）。

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