材料和试剂

微球菌核酸酶（MNase）（Roche Applied Science，目录号：10107921001,15,000U）
蛋白酶K（Roche Applied Science，目录号：03115836001）
PIPES（Sigma-Aldrich，目录号：P-9291）
液氮
蔗糖
KCl
MgCl 2
CaCl <2>
Triton X-100
1mM PMSF（新鲜加入）
Tris/HCl（pH7.8）
EDTA
SDS
溴化乙锭
核提取缓冲液A，B，C（参见配方）
MNase缓冲区（参见配方）
2x停止缓冲区（见配方）
10x蛋白酶K 缓冲区（请参阅配方）

设备

杵和臼
离心机
37℃烘箱
70μm尼龙网
50ml Falcon管
离心管
2 ml微量管
尼龙网

程序

在液氮下用研杵和研钵（预先用液氮冷却）研磨冷冻的拟南芥苗（2g）。
注意：在冰上执行以下步骤。
将均质化的植物材料加入到50ml的Falcon管中的10ml核提取缓冲液A. 通过涡旋混合好。
使用放置在漏斗中的70μm尼龙筛过滤两次步骤2中获得的植物匀浆注意：在步骤4所需的离心管中执行第二个过滤步骤。
在4℃下以10,000×g离心20分钟
通过倾析弃去上清液。
注意：通过移液除去所有的上清液。
将沉淀重悬在200-500μl的核提取缓冲液B中（该体积可以根据沉淀的大小进行调整）。
吸取200-500μl的核提取缓冲液C（它必须与步骤6中使用的体积相同），并将其放入空的2ml Eppendorf管中。
注意：核提取缓冲液C是粘稠的，因为其高蔗糖含量。您应该慢慢执行此步骤，以避免形成气泡。
将来自步骤6的重悬沉淀物加入到步骤7中获得的缓冲液C层上注意：在添加重新悬浮的颗粒时，请注意不要打扰缓冲液C的层。
在4℃下，12,000小时 g离心1小时。
通过移液除去所有上清液。
将沉淀重悬于250μlMNase缓冲液中（此体积可根据沉淀的大小进行调整）。
注意：在这一点上，你可以添加35％甘油到核的样品，将它们浸没在液氮中，并保持在-80°C冷冻，直到MNEs消化将要进行。此时，将细胞核解冻并在4℃下以16,000×g离心20分钟以除去甘油。最后，将核重悬在MNase缓冲液中。
通过测量260 nm处的吸光度来定量DNA浓度。通常应使用1:20的稀释倍数可选：在进行MNase消化之前分析DNA完整性。为此目的，混合等体积的核和2×终止缓冲液，并在4℃下以16,000×g离心10分钟。在用溴化乙锭染色的1.2％琼脂糖凝胶上分析上清液。

图1.在进行MNase消化之前分析DNA完整性为此目的使用几种方法：（A）混合等体积的核和milliQ水; （b）混合等体积的核和2×终止缓冲液，和（B）混合等体积的核和2×终止缓冲液，并如方案中所述进行离心。（C）中的程序给出了最好的结果，并且常规使用
如果要比较不同的样品，执行此步骤，如果不是，可以直接进行MNase消化（步骤14）。用MNase缓冲液稀释样品，以获得所有样品中相同的DNA浓度（通常浓度范围在300 ng /μl和600 ng /μl之间）。
注意：所有样品的最终体积必须相同，必须根据要执行的MNase消化数量进行调整。通常，每次反应使用20μl至40μl。
为了研究对MNase的染色质敏感性，可以使用两种补充方案：在不同孵育时间（步骤15）中，用不同浓度（单位）的MNase消化（步骤14）和/或用期望的MNase浓度消化。
孵育来自步骤13的核的悬浮液与不同单位的MNase，在37℃下15分钟。例如，您可以使用1，2.5，5，10，20，40 U/ml或更高的浓度，直到你观察到高分子量DNA条带的总降解（图2）。为此，通过从酶原液（例如10,000U/ml）制备系列稀释液来制备MNase溶液，以向每个单独的反应中加入相同体积的MNase。例如，等分30μl的细胞核并加入10μl所需浓度的MNase。要停止反应，加入40μl的2x终止缓冲液。最后，加入蛋白酶K 1x缓冲液， 1μl蛋白酶K（原液10mg/ml），并在37℃下孵育过夜
在4℃（*）下，将稀释的核与MNase孵育不同的时间段，以便在所需浓度的MNase下进行时间 - 过程研究。在每个时间点，将20μl的反应转移到含有20μl终止缓冲液2x的eppendorf管中并混合。加入蛋白酶K 1×缓冲液和1μl蛋白酶K（原液10mg/ml），并在37℃下孵育过夜。
（*）MNase的最适消化温度为37℃。在4°C MNase消化比在37°C慢，所以你可以使用更长的消化的孵育时间在4°C比在37°C。
注意：如果观察到样品中的RNA污染，可以在步骤14和步骤15结束时进行RNA酶处理。
向步骤14和步骤15中获得的样品中加入DNA上样缓冲液并通过在用溴化乙锭染色的1.2％琼脂糖凝胶上电泳显现结果。

图2.使用不同浓度的MNase进行MNase消化的实施例。相同量的细胞核在浓度渐增的MNase在37℃消化15分钟，并在1.2％琼脂糖凝胶中分析。

食谱

核提取缓冲液A
0.25 M蔗糖 60 mM KCl
15mM MgCl 2·h/v 1mM CaCl 2
15mM PIPES（pH 6.8）
0.8％Triton X-100 1mM PMSF（新鲜加入）
核提取缓冲液B
0.25 M蔗糖 10mM Tris/HCl（pH8.0）
10mM MgCl 2/
1％v/v Triton X-100 5mMβ-巯基乙醇（新鲜加入）
1mM PMSF（新鲜加入）
核提取缓冲液C
1.7 M蔗糖 10mM Tris/HCl（pH8.0）
10mM MgCl 2/
0.5％Triton X-100 5mMβ-巯基乙醇 1mM PMSF
MNase缓冲区
0.3 M蔗糖 20mM Tris/HCl（pH7.5） 3mM CaCl 2
2x停止缓冲区
50mM EDTA
1％SDS
10x蛋白酶K缓冲液
100mM Tris/HCl（pH7.8）
50mM EDTA
5％SDS

致谢

该协议是为以前在Plant Journal（Moreno-Romero等人，2012年）上发表的工作开发的。这项工作得到了西班牙教育部颁发的赠款BFU2007-60569，BFU2010-15090和Consolider Ingenio 2010 CSD2007-00036的支持，并授权来自加泰罗尼亚的Generalitat de Catalunya，Catalunya（西班牙）的2005SGR-00112和2009SGR-795。。 L.A.和J.M.-R. 分别获得教育部长西班牙和巴塞罗那自治大学奖学金。

参考文献

Moreno-Romero，J.，Armengot，L.，Mar Marques-Bueno，M.，Britt，A.and Carmen Martinez，M.（2012）。 CK2缺陷型拟南芥植物表现出增强的双链断裂修复率，降低了暴露于电离辐射后的存活率。植物J 71（4）：627-638。