材料和试剂

聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P2636）
Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：12800-017）
胎牛血清（Life Technologies，Gibco ，目录号：10437）
2.5％胰蛋白酶溶液（Life Technologies，Gibco ，目录号：15090-046）
DNase（Sigma-Aldrich，目录号：DN25）
青霉素/链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140）
NaH 2 2 PO 4 4 ^。 2H 2
2 2
NaCl
DMEM
FBS
含血清培养基（见配方）
PBS（请参阅配方）

设备

细胞培养孵化器
离心机
立体显微镜
剪刀，钳子和刀子
无菌过滤器（0.45μm）
细胞过滤器70μm尼龙（BD Biosciences，目录号：352350）
24孔培养板

程序

包衣和洗涤培养板。
1. 用无菌PBS稀释聚-L-赖氨酸储备液至100μg/ml。向培养板的每个孔中加入最佳体积的溶液。在24孔培养板的情况下，0.5ml溶液就足够了。涂层允许神经元粘附到培养板
2. 离开板在孵化器至少1小时。之后，用1ml /孔的无菌PBS洗孔两次。使用前完全取出PBS。在PBS洗涤之后不必干燥板。
根据您的机构动物护理和使用委员会的建议选择适当的麻醉。麻醉后，切开头皮，取出头骨。我们使用出生后第1天小鼠来测量皮质脊髓神经元的长度。从幼崽拾取整个大脑，并将其置于冰上的冷PBS中（Chen等人，2007）。
在显微镜下，解剖大脑大脑皮质。去除脑膜和血管。将组织切成小块（1mm立方体），用无菌刀可以
转移组织到50ml管。将组织在10ml胰蛋白酶溶液（0.25％胰蛋白酶，100μg/ml PBS中的DNase）中胰蛋白酶化，并在37℃下孵育15分钟。
加入等量的10％FBS-DMEM，并向上和向下移液器几次以帮助组织解离。
在室温下以300×g离心3分钟，弃去上清液，并将沉淀物重新悬浮在新鲜DMEM（不是10％FBS-DMEM）中。
将细胞通过70μm尼龙细胞过滤器过滤以获得单细胞悬浮液。在室温下将所得细胞悬浮液以300×g离心3分钟。重悬细胞沉淀在新鲜的DMEM（不是10％FBS-DMEM）。
计数细胞数量，并使用10％FBS-DMEM调整浓度。为了测量神经突长度，将细胞以5×10 4个细胞/孔的密度平板在4孔腔室载玻片上。将细胞悬液转移到培养板中，并在37℃下用5％CO 2孵育24小时。为了研究药理学药剂的作用，在细胞接种后2小时改变含有每种药剂的培养基。代表图像显示获得1天培养的神经元III型β-微管蛋白（Tuj-1）标记的皮层神经元。

图1.培养的皮层神经元的图像。代表性图像显示获得1天培养物的神经元III类β-微管蛋白（Tuj-1）标记的皮质神经元。

食谱

聚-L-赖氨酸：将无菌蒸馏水溶解以制备储备溶液（10mg/ml）。保持等分在-20°C。在使用前用无菌PBS稀释。
含血清培养基

试剂
卷

DMEM
445毫升

FBS
50 ml

青霉素/链霉素
5 ml
PBS

试剂
卷

NaH ₂ PO ₄ sub> O
0.312克

12 _{= sub> O} 2.8652 g

NaCl
8.5克

DW
1 L

致谢

这项工作是由日本促进科学协会授予的青年科学家（25710006）的支持，大阪大学大学计划支持当前和未来的研究人员到RM的网络，从JSPS（25221309）到TY的科学研究授权（S）。

参考文献

Chen，Y.，Balasubramaniyan，V.，Peng，J.，Hurlock，EC，Tallquist，M.，Li，J.and Lu，QR（2007）。由CNS炎症诱导的血管生成促进通过血管衍生的前列环素的神经元重塑。 Nat Med 18（11）：1658-1664。