材料和试剂

设备

程序

I. 蛋白质提取方案（保持所有步骤在4°C）

II。 GTP结合测定（反应：终体积200μl）

混合100微升蛋白质在100微升提取缓冲液与80微升反应缓冲液
加入20μl起始缓冲液。
暴露于相应的刺激（光，激动剂等）。
（你应该调整特定的刺激，暴露时间，浓度，强度等，在哪里可以检测到最佳绑定）
在室温下孵育反应10分钟。
加入2ml冰冷的终止缓冲液以完成反应
使用真空通过0.45μm硝化纤维素过滤器过滤反应。我们使用3厘米直径的磁盘
使用真空用2ml冷停止缓冲液洗涤磁盘过滤器5次。该步骤对于洗去未结合的GTPγ³⁵ S是重要的
干膜过滤器，在75℃下包含膜15分钟
将磁盘放在含有2毫升闪烁溶液的塑料小瓶中。
使用液体闪烁计数器记录 S能量范围中的cpm。
重要：非特异性结合必须使用空白反应估计。我们建议两个可能空白的三个重复：没有蛋白质的反应（反应缓冲液加启动缓冲液）或100μg预热至95℃10分钟的蛋白质样品。我们在两个空白之间没有发现GTP结合的差异。
从每个测量样品获得的cpm中减去空白样品获得的平均cpm，得到正确的值。

食谱

反应缓冲液（每次反应使用80μl来自原料）

致谢

该方案改编自Fox等人（2012）。这项工作得到了FonCyT PICT 2010年第1821号到A.M.

参考文献

Fox，A.R.，Soto，G.C.，Jones，A.M.，Casal，J.J.，Muschietti，和Mazzella，M.A。（2012）。 cry1和GPA1信号遗传相互作用在拟南芥中的钩开启和花青素合成。植物分子 Biol.80（3）：315-324。