材料和试剂

显微镜护罩眼镜（Matsunami Glass，24 x 40 mm No.1）
注意：虽然更坚固的玻璃载玻片（厚度为1-1.2 mm）更安全，但如果显微镜的物镜设计为标准的0.17 mm玻璃厚度，则应使用保护玻璃。只有具有长工作距离（ELWD，LWD）的特殊物镜才允许通过厚玻璃片观察。或者，被设计用于没有盖玻片（NCG，NC）的物镜将能够直接观察放置在载玻片上的印记。我使用大（24×40毫米）眼镜制作覆盖大叶面积的印记。更大的玻璃也是有用的，当你把它放在显微镜载物台上。
速溶胶（Aron Alpha Super Set）（Toagosei Co.，目录号：EA936A-5）
注意：Aron Alpha超级套装包括液体胶和加速器。 Aron Alpha在北美和Cyanolit在欧洲作为Krazy Glue销售。
速溶胶剂
注意：虽然我使用由Toagosei制造的真正的加速器，为Aron Alpha（Krazy Glue）开发的第三方加速器将工作正常。你可以观察到气孔没有加速器，但印记可能不太清楚。

设备

带有显微照相设备的光学显微镜
目镜千分尺和平台千分尺
注意：这些是视野测量不可或缺的，除非您的显微镜可以自动计算比例尺。

程序

选择叶子观察。确保它们不会被雨水或露水弄湿（图1）。可以从上（近轴）和下（后轴）表面获取印记。除非有特殊原因，最宽应选择成熟叶片的（中）区域作为目标区域。避免粗糙的主要徒劳，以获得平滑的印记。

图1.米的典型健康叶片。
将几滴促进剂涂在玻璃盖上（图2），并等待直至完全干燥（室温下2-3分钟）（图3）。

图 2.将一滴加速器放在保护玻璃上。

图3.玻璃盖上的干燥加速器
在将一滴速溶胶施加到叶子表面后，立即将盖玻片的加速器侧按在叶子上约30秒（图4和5）。

图 4.瞬间胶水滴在叶片表面。

图 5.干燥胶水混合物。
轻轻地从玻璃盖上取下玻璃盖。确保刻印在盖玻片上（图6）。如果胶水混合物完全干燥，获得的印记将是坚固耐用的。当使用健康叶时，叶片表面上只剩下残余物。

图 6.删除封面眼镜上的印记（左）。

图 7.盖玻片放在显微镜镜台上。在这种情况下，将压印放置在用于成像的盖玻片的上表面上倒置显微镜
在光学显微镜下观察印记（图7）。水稻中的气孔形成为平行于叶的侧面的行或锉（图8）（Hoshikawa，1989）。因此，找到气孔相对容易。拍摄放大图像的照片，通过使用千分尺或内置成像软件计算捕获的叶面积，然后计数打印图像内的所有气孔。我常规地计算在0.42mm 2/d的叶面积内的气孔

图8.中叶反应的典型印记图像。红色圆圈表示气孔的位置。

注意：由于成像通过显微镜给出非常浅的景深，只有一个非常狭窄的区域的图片可能会在一个时间对焦。要解决对焦问题，可以使用自动对焦显微镜或照片处理软件。我常规使用Keyence BZ-9000显微镜用光学软件（Keyence，Osaka，Japan）。具有适当插件（例如，堆栈聚焦器，扩展景深）的ImageJ软件（http://rsb.info.nih.gov/ij/）也产生合理的聚焦合成图像/em> 9）。

图 9.聚焦堆叠。左侧是三个不同的源图片焦深。 Right是由ImageJ生成的合成图像堆栈Focuser插件（http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/stack-focuser.html）。
压印可以在室温下长时间保存而不进行任何密封处理。我可以得到清晰的图像，即使在2年后。

致谢

我感谢Ryoko Kaji的技术援助。这项工作得到了九州大学教育与研究发展项目（P& P），创新地区科学研究资助（第21114002号）和教育，科学和文化部日本（No. 22570045）。

参考文献

Hoshikawa，K。（1989）。生长的水稻：解剖学专着。 Tokyo：Nobunkyo xvi，310p.-illus .. ISBN 245913836.
Kusumi，K.，Hirotsuka，S.，Kumamaru，T。和Iba，K。（2012）。在缺乏SLAC1的水稻突变体中增加的气孔导度引起的叶片光合作用，SLAC1是保卫细胞阴离子通道蛋白质。 J Exp Bot 63 （15）：5635-5644。