材料和试剂

常规Laemmli SDS-PAGE的所有材料
非还原Laemmli样品缓冲液
KCl（Applichem，目录号：A1039）
Triton X-100（Applichem，目录号：A1388）
DTT（Applichem，目录号：A1101）
SDS（SERVA Electrophoresis GmbH，目录号：20765）
丙烯酰胺40％37.5:1（SERVA Electrophoresis GmbH，目录号：10681）
过氧二硫酸铵（Carl Roth，目录号：9592）
TEMED（Carl Roth，目录号：2367）
β-巯基乙醇（Carl Roth，目录号：4227）
碘乙酰胺（Applichem，目录号：A1666）
Tris（Applichem，目录号：A1379）
Na 2 EDTA（Carl Roth，目录号：8043）
Tricine（Carl Roth，目录号：6977）
甘氨酸（SERVA Electrophoresis GmbH，目录号：23390）
琼脂糖（SERVA Electrophoresis GmbH，目录号：11380）
溴酚蓝（Carl Roth，目录号：T116）
滤纸（Munktell，目录号：2.519.580600N）
页面尺度未染色蛋白梯度（Thermo& Fisher Scientific，目录号：26614）
2x细胞裂解缓冲液（见Recipes）
5x非还原Laemmli样品缓冲液（参见配方）
5x减少Laemmli样品缓冲液（见配方）
Laemmli电泳缓冲液（参见配方）

设备

所有设备的常规Laemmli SDS-PAGE

程序

细胞裂解（在4℃下进行所有裂解步骤）
1. 用2x细胞裂解缓冲液（使用1ml裂解缓冲液/1L培养物的沉淀）破碎细胞，重复移液至多5分钟。
2. 溶解蛋白质，终浓度为1％SDS（30分钟，4℃，无需搅拌）
3. 通过最终浓度为0.1M碘乙酰胺（30分钟，4℃，在黑暗中，因为碘乙酰胺在光照下不稳定，不需要搅拌）的烷基化来防止样品的巯基重排。
第一维（请记住，在计算要处理的样本数时，第一维的每个泳道都需要单独的第二维凝胶）
1. 在每个样品中加入适量的非还原Laemmli样品缓冲液，同时保持在凝胶梳的尺寸范围内，使用足够的材料，通过检测方法分析蛋白质。
2. 根据蛋白质的最佳条件使样品变性（例如，许多可溶性蛋白质可以在95℃变性6分钟）。
3. 用您的样品进行Laemmli SDS-PAGE（图1）
第二维
1. 消毒道从凝胶上作为凝胶条纹（图1）。
2. 通过在一定量的Laemmli电泳缓冲液中搅拌您的凝胶条来减少二硫键，所述电泳缓冲液完全覆盖了凝胶条（+ 0.1M DTT [最终浓度]，15分钟，室温）。
3. 通过在Laemmli电泳缓冲液（含有0.1M偶氮乙酰胺[最终浓度]，15分钟，室温，在黑暗中）搅拌凝胶条，通过烷基化防止硫醇重新洗牌。
4. 使用较短的堆积凝胶（比第一维中的堆叠凝胶短约50％，没有孔）制备用于每个凝胶条的第二层和第二层SDS-PAGE的单独的凝胶以适应凝胶条的第一维进入你的凝胶装置
5. 将凝胶条从第一维在水平方向（在左侧的较高分子量，在右侧的较低分子量）放置在第二尺寸的堆积凝胶上方（图1）。
6. 煮0.5％琼脂糖（在具有溴酚蓝的Laemmli电泳缓冲液中[0.75g L -1 -1 ]），并用琼脂糖溶液填充第二维的凝胶（图1）。
7. 在琼脂糖凝固之前，将凝胶条压在第二维的堆积凝胶上（不要改变凝胶条的方向，避免或去除凝胶条和凝胶之间的气泡）（图1）。
8. Pipet蛋白质大小标记在一小条滤纸上，并在琼脂糖凝固之前，将您的凝胶条纹旁边的那张纸粘在琼脂糖溶液中。
9. 运行Laemmli SDS-PAGE作为第二维（来自固化的琼脂糖的溴酚蓝用作流动染料，15cm厚度的17cm凝胶需要在14mA下约16小时）（图1）。
10. 分析您感兴趣的蛋白质（例如，免疫印迹，MS）
11. 具有分子间二硫桥的蛋白质出现在对角线的左侧，因为它们的表观重量从第一维缩小到第二维。
12. 没有二硫键的蛋白质直接出现在2D PAGE的对角线上，因为它们在两个维度之间的电泳图案没有差别。
13. 具有分子内二硫桥的蛋白质出现在对角线的右侧，因为它们的表观重量从第一维增加到第二维。
  
  图1.具有3k-3m中描述的蛋白质结果的步骤2c-3i的方案。

食谱

2x细胞裂解缓冲液
〜200ml dH 2 O
2.24克KCl
97mg EDTA
0.89g Tricine
2.5ml Triton X-100 将pH调节至7.8
用dH <2> O填充至250ml
5x非还原Laemmli样品缓冲液
〜40ml dH 2 O
1.51克Tris
3.75克SDS
0.125g溴酚蓝
将pH调节至6.8
加满dH 2 2至50ml
5x减少Laemmli样本缓冲区
向50ml 5x非还原Laemmli样品缓冲液
中加入0.44mlβ-巯基乙醇
Laemmli电泳缓冲液
〜800ml dH 2 O
3.03g Tris
14.41g甘氨酸
1.5克SDS
填充dH 2 2至1000ml

参考文献

Schwarz，C.，Bohne，A.V.，Wang，F.，Cejudo，F.J.and Nickelsen，J。（2012）。在莱茵衣藻中的叶绿体psbD基因表达的分子间二硫键光开关。 Plant J 72（3）：378-389。
Stroher，E。和Dietz，K.J。（2008）。显示拟南芥叶绿体的动态硫醇 - 二硫化物氧化还原蛋白质组通过差别电泳迁移率。生理植物 133（3）：566-583。