材料和试剂

设备

程序

使用BD FACSAria细胞分选仪，在75μlRLT缓冲液（Qiagen RNeasy Micro Kit）中直接分选4,000个细胞。
使用RNeasy Micro Kit根据制造商的方案从分选的细胞中分离总RNA，而不向RLT缓冲液中加入β-巯基乙醇。根据制造商的说明，使用RNeasy Micro Kit提供的DNase在柱DNA上消化15分钟，并在14μl的RNase/DNase游离水中洗脱。使用NanoDrop 1000的总RNA产量范围为30-80ng。
扩增RNA并使用WT-Ovation Pico RNA扩增系统根据制造商的说明产生具有与原始mRNA互补的序列的cDNA。在NanoDrop 1000上测量的扩增cDNA的预期产量在5-10μg之间。此时可以包括质量控制步骤，通过对预期存在于扩增cDNA库中的已知转录物进行实时PCR。
使用WT-Ovation Exon Module试剂盒根据制造商的说明书从3μg互补序列cDNA产生有义链cDNA靶。
超声处理3微克有义链cDNA，其被稀释至终体积为400μlTris-EDTA pH 8.0缓冲液以产生200-500bp范围的cDNA片段。使用Sonic Dismembrator 550和419 Microtip的超声处理在冰上用六个脉冲（每个20秒）（幅度设置为3）和60秒的休息间隔进行。
使用Qubit HS dsRNA测定试剂盒根据制造商的说明在荧光计上定量有义链超声处理的cDNA，并等分30ng以产生测序文库。

执行末端修复（试剂是TruSeq DNA样品制备试剂盒的一部分）

在热循环仪上20℃30分钟

根据制造商的说明书使用MinElute PCR纯化试剂盒纯化，并在34μl的RNase/DNase游离水中洗脱。在后续步骤中使用所有洗脱的cDNA。
腺苷酸3'端（试剂是TruSeq DNA样品制备试剂盒的一部分）

cDNA
34μl

10x Klenow缓冲区
5微升

1 mM dATP
10微升

Exo-Klenow（5Uμl^-1）
1微升

在热循环仪上37℃30分钟
根据制造商的说明使用MinElute PCR纯化试剂盒进行纯化。用10μl无RNase/DNase的水洗脱。
Ligation配对末端衔接头（试剂是TruSeq DNA样品制备试剂盒的一部分）

cDNA
10μl

2x连接酶缓冲液
15微升

接头寡核苷酸混合物（1/10在水中稀释）
1微升

DNA连接酶
4微升

室温15分钟
使用MinElute PCR纯化试剂盒根据制造商的说明纯化连接反应
通过使纯化的PCR产物通过1.5％琼脂糖凝胶运行，切割150-300bp范围内的涂片，选择cDNA文库，使用QIAquick凝胶提取试剂盒根据制造商的说明书纯化，并用36μlRNA酶/DNA酶自由水。注意，DNA浓度很低，因此凝胶上没有可见的DNA条带。

接头修饰的DNA片段的PCR扩增（试剂是TruSeq DNA样品制备试剂盒的一部分）

在热循环仪
上使用以下协议

通过运行扩增的DNA通过1.5％琼脂糖凝胶验证文库。大多数扩增的cDNA应当出现在150-300bp范围之间。引物二聚体和衔接子出现在30-60bp范围。
通过凝胶提取出现在150-300 bp范围内的DNA使用QIAquick凝胶提取试剂盒根据制造商的说明书，用15μlRNase/DNase游离水（图2）洗脱纯化文库。使用Qubit HS dsDNA测定根据制造商的说明书在荧光计上定量文库最终产率。使用此协议产生的文库产生200-700ng。

图2.沿着100bp梯度的凝胶提取条带的实施例。适配器可见大约30-60 bp。
此时可以包括质量控制步骤，通过对预期存在于所产生的文库中的已知转录物进行实时PCR。如果在步骤3执行质量控制步骤，则在生成库之前，结果应该类似

在Illunina HiSeq 2000上运行cDNA文库。所有样品的比对统计以及hESC RNA-Seq文库的3个重复的相关性评分显示在表1和2中。

表1.对齐统计信息

表2. hESC RNA-Seq图书馆的相关性分数

致谢

A.T.C. 由NIH/NICHD 2 R01 HD058047的资金支持。

参考文献

Gkountela，S.，Li，Z.，Vincent，J.J.，Zhang，K.X.，Chen，A.，Pellegrini，M.and Clark，A.T。 cKIT +人类原始生殖细胞的个体发育证明是人类种系重编程，印迹擦除和体外分化。 Nat Cell Biol 15（1）：113-122