材料和试剂

无菌96孔透明平底板（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353072）
酚红免费Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：21063-029）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）（Sigma-Aldrich，目录号：I5879）
吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：P2287）
HEPES（Life Technologies，Gibco ，目录号：11344-041）
100％乙醇
Milli-Q H sub 2 O 2 /
Alphascreen cAMP测定试剂盒（PerkinElmer，目录号：6760625）
White OptiPlate-384孔微孔板（PerkinElmer，目录号：6007290）
TopSeal（PerkinElmer，目录号：6005250）
刺激缓冲区（参见配方）
裂解缓冲液（见配方）
接受者缓冲区（参见配方）
捐助者缓冲区（参见配方）

设备

Fusion-α板读取器或Envision读板器和适当的alphascreen模块（PerkinElmer）
加湿孵化器
多通道移液器
微量移液器
台式离心机
烤箱
轨道抖动

程序

注意：
1）细胞可以稳定或瞬时表达感兴趣的受体。
/sub> ，除非另有说明。

I. 细胞制备

在合适的营养培养基（例如DMEM，10％FBS，无抗生素）中将细胞接种到无菌96孔板中，并在37℃，5％CO 2的潮湿环境中培养， /约为〜90％，第二天融合（约24小时）。
注意：根据所使用的细胞系对细胞数目的优化是必要的（我们建议起始范围为10,000-50,000个细胞/孔）。 CHO FlpIN细胞的推荐密度为30,000个细胞/孔

II。刺激

播种后的一天，吸入营养培养基并更换为90μl预热的刺激缓冲液
在37℃，5％CO 2的潮湿环境中孵育30分钟。
注意：刺激前不要在刺激缓冲液中离开细胞超过2小时。
准备在刺激缓冲液中10×终浓度的配体的系列稀释液，以足够10μl/孔，一式两份（最小）。
注意：使用的浓度范围将取决于配体对受体的亲和力。对于初始测试，选择最高浓度100×K d配体，仅缓冲液对照，以及这些之间的几个浓度。然后可以在后续实验中细化范围。
准备10倍适当浓度的毛喉素在刺激缓冲液中。
注意：这是实验的内部对照 - forskolin是腺苷酸环化酶的激活剂，增强cAMP的形成。在CHO FlpIN细胞系中推荐的毛喉素的最终浓度为100μM。
在刺激缓冲液中孵育30分钟后，向细胞中加入10μl10x制备的配体，总体积为100μl，最终浓度为1x。
在37℃，5％CO 2的潮湿环境中与配体孵育细胞30分钟。
注意：需要优化测定时间。推荐的初始刺激为30分钟。
30分钟后，从细胞中快速除去含配体的培养基。
注意：根据细胞类型，这可能涉及轻拂或轻柔吸气。
加入50微升冰冷的100％乙醇的细胞。
让乙醇在室温（RT）或37℃烘箱中蒸发注意：确保乙醇完全蒸发，然后再进行下一步骤。
加入75μl裂解缓冲液。
注意：裂解体积的优化是必要的，并且取决于细胞类型，受体的表达水平和偶联到cAMP途径的效率。在CHO FlpIN细胞系中推荐的起始裂解体积为75μl。
孵育裂解物在室温下5-10分钟在轨道摇床

III。检测

在减光条件下，准备检测试剂（受体和供体缓冲液）
转移10微升细胞裂解物到384孔OptiPlate。
在裂解缓冲液中制备cAMP标准曲线，足以以10μl/孔重复（最小）进行
转移10微升cAMP标准曲线到384孔OptiPlate
短暂离心以将内容物吸到孔底部
在减光条件下，向每个孔中加入5μl受体缓冲液（样品和标准曲线）
在减少照明条件下，向每个孔（样品和标准曲线）中加入15μl供体缓冲液（预温育30分钟后）。
用TopSeal密封板并用箔包裹。
注意：小体积容易蒸发，TopSeal是至关重要的。
短暂离心以将内容物吸到孔底部
在室温（8-12小时）在减光条件下孵育过夜
短暂离心以将内容物吸到孔底部
使用标准α屏幕设置在Fusion-α或Envision读板仪上分析发光

IV。数据分析

从cAMP标准曲线推断数据。理想情况下，数据应位于cAMP标准曲线的线性部分。
1. 如果数据从曲线的底端（即，cAMP的高浓度）下降，用裂解缓冲液进一步稀释裂解物，并且方案的重复检测组分。
2. 如果数据从曲线的顶端脱落（ i ，cAMP浓度低）用较低体积的裂解缓冲液裂解。
将数据规范化为forskolin控制。

食谱

刺激缓冲液（pH 7.4，使用前在37℃下孵育）
无酚DMEM
0.1％w/v BSA *
* BSA不是必需的，但推荐用于"粘性"配体，即肽。
** IBMX是一种有效的磷酸二酯酶抑制剂。 IBMX粉末应该是
在100％DMSO中的500mM储备液。如果DMEM太冷，可能从溶液中沉淀出来，因此在添加IBMX时轻轻加热并搅拌DMEM
裂解缓冲液（pH 7.4）
Milli-Q H sub 2 O 2/0.3％Tween 20
5 mM HEPES
0.1％w/v BSA
受体缓冲液（在刺激缓冲液中制备）
1％受体珠（10 U /μl）（使用前用移液管轻轻混匀）
供体缓冲液（在刺激缓冲液中制备）***
0.3％供体珠（10U /μl）（使用前通过移液轻轻混合）
0.025％生物素化的cAMP（133U /μl） ***供体缓冲液在使用前必须在RT预温育30分钟
cAMP标准曲线
准备在3x浓度的裂解缓冲液中的cAMP标准稀释系列，以考虑检测板中的稀释（10μlcAMP标准品，5μl受体缓冲液和15μl供体缓冲液，终体积30μl）。 cAMP标准品（最终）的推荐浓度范围为10μM - 1 pM，以半对数单位表示。
注意：裂解物可以储存在-20°C，cAMP累积可以稍后检测，但刺激后不超过2周。

参考文献

Koole，C.，Wootten，D.，Simms，J.，Valant，C.，Sridhar，R.，Woodman，O.L.，Miller，L.J.，Summers，R.J.，Christopoulos，A.and Sexton，P.M。胰高血糖素样肽1受体（GLP-1R）的变构配体差异调节内源和外源肽 response in a pathway-selective manner：implications for drug screening。 Mol Pharmacol 78（3）：456-465。