材料和试剂

血（谢菲尔德输血服务）
50ml falcon管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：734-0451）
Hank's平衡盐溶液（HBSS）（不含钙，Ca 2+和Mg 2+，Mg 2+）（Lonza BioWhittaker Ltd.，目录号：10-543Q）
Ficoll-Hypaque（GE Healthcare，目录号：17-1440-02）
IMDM培养基（Lonza BioWhittaker Ltd.，目录号：12-722）
人AB血清（Lonza BioWhittaker Ltd.，Wokingham，UK）
L-谷氨酰胺（Lonza BioWhittaker Ltd.，目录号：17-605）
RPMI培养基（Lonza BioWhittaker Ltd.，目录号：12-115）
胎牛血清（FBS）（Biosera，目录号：FB-1000）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Lonza BioWhittaker Ltd.，目录号：17-516F）
胰蛋白酶/EDTA（Promocell有限公司，目录号：C-41000）
腺病毒（我们实验中使用的腺病毒包括AdCMV-GFP和溶瘤Ad [1/PPTE1A]）（来自瑞典乌普萨拉的Magnus Essand教授的赠品）
缺氧驱动质粒（HRE-E1A/B）
巨噬细胞Amaxa Nucleofector 试剂盒（Lonza BioWhittaker Ltd.）

设备

T75组织培养瓶（BD Biosciences，Falcon ）
12孔板（BD Biosciences，Falcon ，目录号：734-2324）。
离心机（MSE Mistral 2000R）
血球计（Camlab有限公司，目录号：1127884）
Nucleofector 机器（Lonza BioWhittaker Ltd.）

程序

I. 单核细胞分离

谢菲尔德教学医院（STH）采集的静脉血银行从健康捐助者收集并合并成一袋废白毛皮。
将25ml该血液倒入50ml中 Falcon管中，然后用15ml HBSS填充至40ml管线（不含钙，Ca 2+和镁，Mg 2+和）。
然后将管在1,200×g下旋转20分钟（4℃，制动速率为0）。
后纺丝，多云白细胞层（在血浆下）通过移液管取出并收集转移到两个新的50ml中 Falcon管中，其中用HBSS（w/o Ca 2+ + Mg 2+/sup>）补充至30ml。
然后将30ml白细胞小心地铺在20ml Ficoll-Hypaque（在50ml Falcon管中）的顶部。
然后将这些管置于离心机中，并再次以1,200×g（4℃，制动速率为0）旋转20分钟。
再次，除去混浊的白色细胞层，并在新的50ml Falcon中用HBSS（w/o Ca 2+ +/Mg 2+ 2+）补充至40ml 管。
然后将该管在400×g下旋转5分钟（4℃，制动速率为3），以洗涤细胞并使其沉淀。
该过程重复三次。
的然后使用血细胞计数器计数细胞，并用IMDM稀释（补充有2％人AB血清和4mM L-谷氨酰胺），使得在那里为5-7×10 6个细胞/ml。
平板细胞下1毫升将该细胞悬浮液加入到每个T75（BD falcon-这些烧瓶优越的感染病毒）烧瓶和加满 10毫升与补充的IMDM。然后将细胞孵育2小时小时（37℃，5％CO 2）。 2小时后，用HBSS洗涤烧瓶以除去非粘附细胞，然后用10ml的补充物补充补充IMDM。

II。单核细胞亚培养和分化成单核细胞衍生的巨噬细胞（MDM）

如上所述分离的单核细胞，并在补充有L-谷氨酰胺（4mM）和人AB血清（2％）的10ml IMDM中培养第一个24小时。此后，用5ml补充有L-谷氨酰胺（4mM）和10％FBS的RPMI替换培养基。每三天更换培养基，取决于进行的其他操作和单核细胞衍生的MDM。巨噬细胞在24小时后可见，它们具有与单核细胞不同的形态，其是非粘附的和球形的。另一方面，巨噬细胞较大且具有不规则的特征。可以拥有树突和出现纺锤形。

III。 MDM的共转导

MDM与治疗性溶瘤腺病毒和携带病毒E1A的复制组分的低氧调节的质粒共转导。病毒和质粒的描述可以在（Muthana等人，2013; Muthana等人，2011）中找到。

注意：用于本研究的腺病毒包括AdCMV-GFP和溶瘤Ad [1/PPTE1A]。

人类腺病毒的MDM感染
1. 第二天用HBSS洗涤接种的单核细胞重悬于5ml RPMI（补充有10％FBS， L-谷氨酰胺）。这防止病毒与人AB血清结合 IMDM和中和病毒颗粒
2. 以多重感染（MOI）100加入病毒颗粒，并置于孵育箱中过夜
3. 后过夜温育，将细胞在PBS中洗涤并且新鲜补充的RPMI培养基。通过流量评估病毒感染细胞计数和荧光显微镜用于表达绿色荧光蛋白（GFP）报告基因。
使用Amaxa核转染法转染MDM
1. 24小时后，使用trysin/EDTA收获感染的巨噬细胞，然后使用巨噬细胞Amaxa Nucleofector 试剂盒用缺氧驱动的质粒（HRE-E1A/B）转染。这根据制造商的方案进行。简言之，将补充有10％FCS和L-谷氨酰胺的RPMI（1.5ml）加入12孔板的孔中并在37℃下预孵育。
2. 将三日龄MDM胰蛋白酶化，在400×g离心5分钟（在室温下），并以8×10 5个细胞/ml重悬。完全弃去上清液，加入100μlAmaxa Nucleofector溶液以及3μg质粒（HRE-E1A/B）。然后将细胞悬浮液插入Nucleofector 机器中，并选择Y-10程序。一旦机器显示"OK"，取出样品，加入500μl预热的补充有10％FCS和L-谷氨酰胺的RPMI，将整个细胞悬浮液转移到适当标记的孔中。然后将12孔板孵育24小时。使用根据制造商的方案提供的试剂盒提供的pmaxGFP质粒优化质粒转染。简言之，在荧光显微镜和流式细胞术转染后24-48小时评估GFP表达。
3. 共转导的巨噬细胞可以在体外（例如3D肿瘤球体）递送至肿瘤细胞或静脉内递送至荷瘤小鼠。可以确定作为OV杀伤的结果的肿瘤细胞死亡。

致谢

该协议改编自Muthana等人（2011）和Muthana等人（2013）。

参考文献

Muthana，M.，Rodrigues，S.，Chen，Y. Y.，Welford，A.，Hughes，R.，Tazzyman，S.，Essand，M.，Morrow，F.and Lewis，C.E。巨噬细胞溶瘤病毒的递送消除了化疗或照射后的肿瘤再生和转移。 em> Cancer Res 73（2）：490-495。
Muthana，M.，Giannoudis，A.，Scott，SD，Fang，HY，Coffelt，SB，Morrow，FJ，Murdoch，C.，Burton，J.，Cross，N.，Burke，B.，Mistry，，Hamdy，F.，Brown，NJ，Georgopoulos，L.，Hoskin，P.，Essand，M.，Lewis， C. E.和Maitland，N.J。（2011）。使用巨噬细胞将治疗性腺病毒靶向人前列腺肿瘤癌症研究 71（5）：1805-1815。