材料和试剂

胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10270）
200mM L-谷氨酰胺（100x）（Life Technologies，Gibco ，目录号：25030）
青霉素 - 链霉素（100x）（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-122）
氢化可的松（Sigma-Aldrich，目录号：H-0888）
胰岛素（人，重组）（F.Hoffmann-La Roche，目录号：11376497001）
雌二醇（β-雌二醇）（Sigma-Aldrich，目录号：E8875）
蛋白酶抑制剂混合片剂（LAP片剂）（F.Hoffmann-La Roche，目录号：11836153001）
蛋白A-琼脂糖快速流（Sigma-Aldrich，目录号：P3476）
Formaldeyde（Sigma-Aldrich）
鲑鱼精子DNA
DPBS（Sigma-Aldrich，目录号：D5652）
蛋白酶K（F.Hoffmann-La Roche，目录号：03115879001）
Qiagen PCR纯化试剂盒
免疫沉淀抗体（ER-α）（Sigma-Aldrich，目录号：E1396）
引物CCDN1基因座（-1039至770bp）：Fw（-1039）（AACAAAACCAATTAGGAACCTT），Rv（λ770）（ATTTCCTTCATCTTGTCCTTCT）
引物CCDN1启动子（-235至-53bp）：Fw（-235）（TATGAAAACCGGACTACAGG）和Rv（λ53）（CTGTTGTTAAGCAAAGATCAAAG）
木炭葡聚糖剥离血清（CSS）（参见配方）
酚红无Dulbecco改良培养基（具有PR的DMEM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：31885）（用于MCF-7细胞）（参见Recipes）
补充有炭（对于MCF-7细胞）（参见Recipes）的无酚红的Dulbecco's改良培养基（DMEM w/o PR）（Life Technologies，Gibco ，目录号：11880） >
50x LAP（蛋白酶抑制剂混合物）（参见配方）
DTT解决方案（参见配方）
缓冲区I（参见配方）
缓冲液II（参见配方）
缓冲液III或细胞裂解缓冲液（参见配方）
缓冲液IV（参见配方）
TSE I缓冲区（请参阅配方）
TSE II缓冲区（参见配方）
TSE III缓冲液（参见配方）
TE缓冲区（参见配方）
洗脱缓冲液（见配方）
PCR缓冲液（见配方）

设备

超声波仪（配备有3mm直径的尖端）（Sonics& Materials Inc.，型号：Vibracell VC 130PB）
100毫米培养皿
离心机（Eppendorf离心机，型号：5417R）
振动器
PCR热循环仪

程序

将MCF-7细胞接种在100mm皿中，在苯酚红Dulbecco改良培养基中约40-50％细胞汇合。 12-18小时后，用补充有CSS的无酚红的Dulbecco's改良培养基代替红色酚培养基。将细胞维持在该培养基中3或4天（在100mm培养皿中80％汇合）。
刺激细胞与10 nM雌二醇不同时间从15至75分钟。（通常在激素治疗30-40分钟后观察到最大ER结合至染色质）。使用未刺激细胞作为阴性对照。
激素刺激后，用冷PBS（5-10ml）洗涤细胞两次
交联细胞与10ml 1％甲醛的PBS溶液在室温下10分钟。在使用前立即将甲醛加入PBS中。
用冷PBS（5-10ml）冲洗细胞两次
加入1ml DTT溶液，并使用细胞刮刀将细胞收集在1.5ml管中
收集后，在30℃下孵育细胞15分钟，并在3,000RCF离心4或5分钟。
用1ml PBS洗涤沉淀物3次，每次洗涤后，以3000RCF离心3分钟
用1ml缓冲液I用50x LAP，1ml缓冲液II用LAP顺序洗涤沉淀
悬浮细胞沉淀在300微升缓冲液III与50x LAP和在冰上孵育10分钟
在30-40％振幅和0.4W强度下超声处理三次，每次35秒，以获得200bp的DNA片段。在超声处理期间，将样品保持在冰上
要定义超声处理的幅度，强度和持续时间，您可以使用MCF-7细胞样品，在不同强度，幅度和持续时间超声，并检查在琼脂糖凝胶上运行超声处理的DNA的DNA片段大小。正确的条件将是允许您获得中心在大约200 bp的DNA涂片的条件
离心细胞裂解液在20,000 RCF在4°C 10分钟，收集上清液，稀释10倍，使用缓冲液IV与50x LAP。存放在架子上，并在4°C保持3或4小时或过夜（O.N.）
为了制备蛋白A-琼脂糖（每个样品40μl50％），用TE溶液洗涤所需量的树脂两次（蛋白A-琼脂糖体积的10倍）。通过短暂离心收集蛋白A-琼脂糖。最后一次洗涤后，丢弃TE溶液，并加入新鲜的TE溶液和鲑鱼精子DNA（每个样品20μlTE溶液和2μg鲑鱼精子DNA）。保持在4°C的旋转平台3或4小时或O.N。
在20,000RCF下清除样品10秒。储存于-80°C或立即使用免疫沉淀和裂解物。将总上清液的20％保存为总输入对照，并以交联反转步骤开始的洗脱IP进行处理。
将免疫沉淀抗体（2μlER-α）加入新管中的0.7ml样品级分中，沉淀6小时或过夜。对于阴性对照，用1μl（2μg）兔IgG孵育0.7ml样品级分。将所有样品保存在4℃的旋转平台上。
在4℃下加入40μl封闭的蛋白A-琼脂糖珠，旋转O.N.如果你用抗体孵育样品6小时或2-3小时，如果你用抗体O.N.孵育样品。
通过在4℃下离心（3,000xg）沉淀小球珠，并用1ml TSE I，1ml TSE II和500μlTSE III依次洗涤10分钟。用1ml TE缓冲液洗涤三次。
用300μl新鲜制备的洗脱缓冲液洗脱。每次准备缓冲液新鲜。短暂涡旋混合并在涡旋振荡器上轻轻摇动10分钟。
以20,000rpm离心10分钟，将上清液转移至清洁管，并在100μl冷冻输入对照中加入200μl洗脱缓冲液。
通过在65℃下加热使反面甲醛交联
向每个样品中加入18μl1M Tris-HCl pH6.5 0.5M EDTA和5μg蛋白酶K，并在48℃加热90分钟。
使用Qiagen PCR纯化试剂盒分离DNA
分离DNA的另一种方法是1×苯酚/氯仿提取，1×氯仿提取，O.N。使用2.5体积的无水乙醇，用30μl乙酸钾3M，pH 5.7和5μg糖原进行沉淀。用500μl70％乙醇洗涤沉淀两次并风干
重悬颗粒在35微升TE与0.1毫克/毫升核糖核酸酶。
使用每个反应2μlDNA进行常规PCR。例如，对于CCDN1基因座（-1039至-770bp）或CCDN1启动子（-235至-53bp）PCR，使用20μl含有1.5mM MgCl 2的H 2 O溶液0.2mM dNTP，0.25μMPRIMER F，0.25μMPRIMER R，0.5U /μlTAQ Pol，2μlDNA和2μlPCR缓冲液。使用33-35个循环的扩增（变性96℃20秒，退火50℃90秒，延伸69℃60秒）。在2％琼脂糖凝胶中在TBE 0.5％中运行

食谱

木炭葡聚糖剥离血清
葡聚糖包被的木炭用于从血清中除去类固醇激素。木炭/葡聚糖剥离的血清是可商购的，但是我们如Migliaccio等人所述制备血清。（2011）。
用于MCF-7细胞（具有PR的DMEM）的无酚红的Dulbecco's改良培养基
5％FBS
2mM L-谷氨酰胺 100U/ml青霉素 - 链霉素 3.75 ng/ml氢化可的松
6 ng/ml胰岛素
添加MCF-7细胞用炭的无酚红Dulbecco's改良培养基（DMEM w/o PR）
5％CSS
2mM L-谷氨酰胺 100U/ml青霉素 - 链霉素 3.75 ng/ml氢化可的松
6 ng/ml胰岛素
50x LAP（蛋白酶抑制剂混合物）
将片剂溶解在1ml蒸馏的H 2 O中，并使用50×
DTT解决方案
10 mM DTT
100mM Tris-HCl
pH 9.5
缓冲区I
0.25％Triton X-100 10 mM EDTA
0.5mM EGTA 10 mM Hepes
pH 6.5
缓冲区II
200 mM NaCl
1mM EDTA
0.5mM EGTA 10 mM Hepes
pH 6.5
缓冲液III或细胞裂解缓冲液
1％SDS
10 mM EDTA
50mM Tris-HCl（pH8.1） 50x蛋白酶抑制剂混合物
缓冲区IV
1％Triton X-100 2mM EDTA 150mM NaCl 20mM Tris-HCl（pH8.1）
TSE I缓冲区
0.1％SDS
1％Triton X-100 2mM EDTA 20mM Tris-HCl（pH8.1） 150mM NaCl
TSE II缓冲区
0.1％SDS
1％Triton X-100 2mM EDTA 20mM Tris-HCl（pH8.1） 500 mM NaCl
TSE III缓冲区
0.25 M LiCl
1％NP40
1％脱氧胆酸钠
1mM EDTA
10mM Tris-HCl（pH8.1）
TE缓冲区
20mM Tris-HCl（pH8.1） 1mM EDTA（pH8.0）
洗脱缓冲液
1％SDS
0.1 M NaHCO 3 3/v/v
PCR缓冲区
300 mM Tris-Base
100 mM Hepes
250 mM氯化钾
200 mM谷氨酸钾
20 mM DTT
50％甘油
过滤灭菌

致谢

这项工作由意大利癌症研究协会资助（A.I.R.C;批准号IG 5389）。 Pia Giovannelli获得了A.I.R.C.的奖学金支持。该协议改编自Castoria等人（2012）。

参考文献

Castoria，G.，Giovannelli，P.，Lombardi，M.，De Rosa，C.，Giraldi，T.，de Falco，A.，Barone，MV，Abbondanza，C.，Migliaccio，A.and Auricchio，（2012）。 Src对雌二醇受体的酪氨酸磷酸化调节乳腺癌中其激素依赖性核输出和细胞周期进展细胞。癌基因 31（46）：4868-4877
Lombardi，M.，Castoria，G.，Migliaccio，A.，Barone，MV，Di Stasio，R.，Ciociola，A.，Bottero，D.，Yamaguchi，H.，Appella，E。和Auricchio， 2008）。乳腺癌细胞中雌激素受体和DNA合成的激素依赖性核输出。 em> J Cell Biol 182（2）：327-340。
Migliaccio，A.，Castoria，G.，Auricchio，F。（2011）。分析细胞信号传导途径中的雄激素受体快速作用：受体/Src结合。 em> Methods Mol Biol 776：361-370。
Yahata，T.，Shao，W.，Endoh，H.，Hur，J.，Coser，KR，Sun，H.，Ueda，Y.，Kato，S.，Isselbacher，KJ，Brown，M。和Shioda， T.（2001）。 CITED1 CBP/p300结合蛋白的雌激素依赖性转录的选择性共激活。 Dev 15（19）：2598-2612。