材料和试剂

小鼠
PBS
磷酸酶抑制剂（例如PhosStop）（F.Hoffmann-La Roche，目录号：04906845001）
HEPES
EDTA
蒸馏水
葡萄糖
蛋白酶抑制剂（例如，Complete）（F.Hoffmann-La Roche，目录号：11697498001）
解决方案A（参见配方）
2.5 M蔗糖原料（见配方）
蔗糖溶液（0.8 M和1.6 M）（参见配方）

设备

一双剪刀
大脑罩
Falcon管（15ml）
离心机
超速离心机
超速离心机转子（T70.1 Ti和Sw41Ti）
用于T70.1Ti转子的超速离心管（聚碳酸酯，16×76mm）（Beckman Coulter，目录号：355651）
用于SW41 Ti转子（14×89mm）（Seton Open-Top Polyclear离心管，目录号：7030）的超速离心管
Thomas ^®特氟龙杵（A.H Thomas Co.，型号：3431-E20）
1和10ml注射器
针（18和27 G）
Gradient Master 107ip（BioComp，型号：107），带有标记块和插管
折射计

程序

通过颈脱位处死小鼠; 将鼠标放在坚硬，平坦的表面上。用坚固的棍子或金属杆牢牢地靠在颅骨的基部，用另一只手牢固地固定尾部。通过一次快速动作将鼠标身体从头部拉出。通过感觉到颈椎之间的分离来验证脱臼
剪下的小鼠的头，用一把剪刀打开头部的皮肤。
使用一把剪刀打开鼠标的头骨，轻轻地使用大脑舀出暴露的大脑，并转移到冰冷的PBS。
大脑在冰冷的PBS中快速冲洗
将大脑置于10ml含有蛋白酶抑制剂的溶液A中，并在所有大脑分离后继续指向9
对剩余的小鼠重复步骤1-7。
使用Thomas Teflon Pestle将脑匀浆。
将匀浆的脑组织转移到15毫升Falcon管
在4℃下以1,000xg离心10分钟。
转移上清液（通常有几层上清液 - 把它们全部）到一个新的15毫升Falcon管
在4℃下以3,000xg离心10分钟。
将上清液转移到超速离心管中。
使用具有T70.1Ti转子的超速离心机在13,000rpm离心10分钟。
转移上清液到新的超速离心管，并在50,000 rpm离心45分钟在4°C（使用相同的转子（T70.1 Ti转子）如前一步骤）。
注意：在这个离心步骤中，可以制备蔗糖梯度。
弃去上清液。
溶解颗粒在600μl含蛋白酶抑制剂的溶液A.使用1毫升注射器先用18 G针，然后用27 G针溶解小丸
小心地将500μl匀浆（=溶解沉淀）层叠在连续的0.8至1.6M蔗糖梯度的顶部上，并使用SW41Ti摆动叶片转子以25,000rpm离心18小时/过夜。
准备渐变的注意事项：
2. 在标记块中插入一个管，在管的半满标记处标记一条4毫米的短帽。
3. 向管中加入5.5ml 0.8M蔗糖溶液。
4. 使用套管（与Gradient Master一起接受套管）和10ml注射器，在0.8M蔗糖溶液下添加1.6M蔗糖，直到0.8M蔗糖溶液的底部达到最近标记的线。
6. 通过在BioComp Gradient Master的"渐变菜单"列表中选择"SW41"来准备10-57％的线性梯度。该程序将混合梯度在50度10分钟，然后在80度1分钟。
第二天，使用1ml移液管将梯度分级为24个样品（500μl/样品）。或者，可以使用活塞梯度分馏器收集馏分。
将馏分储存在-20℃，直到蛋白质印迹分析

笔记

尽快执行步骤1-9。
在冰上尽可能多的步骤。
记得在进行超速离心之前称重样品的重量平衡。使用溶液A调整重量。
储存的级分应在冰上解冻并涡旋，然后制备用于Western印迹分析的样品。

食谱

溶液A（200ml）
0.25mM蔗糖 1mM EDTA
20mM HEPES（pH7.4）将17g蔗糖与约100ml dH 2 O混合加入400μlEDTA（500mM储液，最终浓度为1mM）加入8ml HEPES（500mM储备液，至终浓度为20mM）将dH 2 O加至最终体积为200ml
pH 7.4
存储在4°C
2.5M蔗糖原液（580ml） 500克蔗糖
此时加入少量蒸馏水，同时加热，直到最终体积约580 ml 测量折射率，以确保浓度约为2.5 M/m 储存于4°C。
0.8M蔗糖溶液（50ml）在10mM HEPES（pH7.2）中的溶液 16ml 2.5M蔗糖储备液
1ml HEPES（500mM储液，最终浓度为10mM）（pH7.2）加入33ml dH 2 O至最终体积为50ml
混合所有成分
如果溶液是在实验前不久在4°C储存，否则溶液可以储存在-20°C
1.6M蔗糖溶液（50ml）在10mM HEPES（pH7.2）中的溶液 32ml 2.5M蔗糖储备液
1ml HEPES（500mM储液，最终浓度为10mM）（pH7.2）加入17ml dH 2 O至最终体积为50ml
混合所有成分
如果溶液是在实验前不久在4°C储存，否则溶液可以储存在-20°C

参考文献

Gustafsen，C.，Glerup，S.，Pallesen，L.T.，Olsen，D.，Andersen，O.M.，Nykjaer，A.，Madsen，P.and Petersen， Sortilin和SorLA在淀粉样前体蛋白的加工和运输中显示出不同的作用。 J Neurosci 33（1）：64-71