材料和试剂

从1-3天龄小鼠中提取的小鼠脑，在液氮中冷冻并保持在-80℃（至多1年）
蔗糖
纯化（例如使用Millipore的Milli-Q系统）保持在4℃的水
微型无EDTA蛋白酶抑制剂混合片（Roche Applied Science，目录号：05892791001）
PMSF（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
乙醇
80％蔗糖（见配方）
均质缓冲液（参见配方）
0.75M蔗糖缓冲液（见配方）
1M蔗糖缓冲液（见配方）
2.33 M蔗糖缓冲液（见配方）

设备

Potter匀浆器（Thermo Fisher Scientific，目录号：08-414-14A）
1ml塑料移液管（Sarstedt，型号：86.1180）
具有角转子的台式离心机，例如Allegra X-15R（Beckman Coulter）
具有摆动转子的超速离心机，例如具有SW40Ti转子（Beckman）的L-60超速离心机或具有P40ST转子（Hitachi）的HIMAC CP100WX超速离心机
离心管13PA（日立，目录号：332901A）

程序

提前准备80％蔗糖，并保持在4℃
在制备生长锥之前立即制备用于匀浆和离心的缓冲液，并将其置于冰上
从-80°C冰箱取10个大脑，并将它们放在冰上。立即进行下一步。
将大脑转移到Potter匀浆器中并加入匀浆缓冲液。每1只大脑使用1ml缓冲液匀浆
均匀化大脑。
注意：如果你隔离几个实验组的生长锥，使用相同数量的笔划来均化每个组中的大脑。
使用台式离心机在4℃下在1660×g离心匀浆15分钟。
收集上清液。
制备不连续的0.75/1.0/2.33 M蔗糖密度梯度。为了制备梯度，小心地移液管离心管1ml冰冷的2.33M蔗糖缓冲液（底部），然后3ml冰冷的1.0M蔗糖缓冲液，然后4ml冰冷的0.75M（顶部）蔗糖缓冲液。为离心管13PA给出体积。为了防止在梯度制备期间蔗糖层的混合，倾斜管并且将移液管的尖端抵靠在管顶部的管壁上（图1）。缓慢释放溶液到管中。

F igure 1. rifuge管和移液器在蔗糖梯度形成期间的位置
将上清液加载到梯度的顶部，并在4℃下以242,000×g离心60分钟。
收集生长锥富集部分在负载和0.75 M蔗糖之间的界面（图2A）。可以在0.75M和1.0M蔗糖之间收集生长锥消耗的部分（图2A），并且可以用作非生长锥膜。为了收集生长锥富集部分，挤压1ml塑料吸管的灯泡，然后小心地将吸管的尖端放入含有生长锥的蔗糖梯度层（图2B），然后缓慢释放移液管以允许含生长锥的溶液流入移液管。然后小心地从离心管中取出含有生长锥的移液管，并将生长锥组分释放到干净的离心管中。如果需要，重复。

图2.来自蔗糖梯度的生长锥富集级分的收集 A：在离心管中蔗糖层和富含生长锥和非生长锥膜的含有级分的界面的分布，离心。 B：在收集生长锥富集级分期间塑料移液管的尖端的位置。
通过将该缓冲液加入到管中以将其填充至容量，将缓冲液中的生长锥部分再悬浮用于匀浆。在4℃下以100,000×g离心40分钟。
收集含有生长锥的沉淀，将其重悬在50μl的匀浆缓冲液中并在-80℃下冷冻。重要的是，匀浆缓冲液必须含有蛋白酶抑制剂，如"食谱"一节中所述。由此获得的生长锥可以在-80℃储存长达1周用于Western印迹分析。必须立即使用用于功能分析（例如外泌和胞吞作用的分析）的生长锥，并且不能冷冻。
注意：为了检查生长锥分离效率，可以通过Western印迹分析生长锥富集的部分。当与脑匀浆和非生长锥膜相比时，生长锥部分必须富集生长相关蛋白（GAP-43）和神经细胞粘附分子（NCAM）。还包含高尔基体膜的非生长锥膜必须富含高尔基体基质蛋白GM130，而生长锥部分应当仅具有低水平的该蛋白，这是由于在生长锥中存在高尔基体衍生的囊泡。 em>

食谱

80％蔗糖对于500ml溶液
在干净的500ml锥形瓶中称取400g蔗糖向烧瓶中加水至500毫升。
将烧瓶置于磁力搅拌器加热板上，并用磁力搅拌器混合，直到蔗糖溶解。您可以将溶液加热至50°C以提高蔗糖溶解度。
溶液可以在4℃下储存长达1个月。
均匀化缓冲液
5mM Tris-HCl
0.32 M蔗糖 1mM MgCl 2
对于100毫升的缓冲区
13.6ml 80％蔗糖 0.1ml的1M MgCl 2溶液 0.5ml的1M Tris-HCl缓冲液（pH7.4） 85.8ml水
混合好，并保持在冰上。在使用前添加蛋白酶抑制剂。使用一片无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物和10μl的1mM PMSF用于10ml缓冲液。片剂需要一些时间才能溶解。
0.75 M蔗糖对于100毫升的缓冲区
32ml 80％蔗糖 0.1ml的1M MgCl 2溶液 0.5ml的1M Tris-HCl缓冲液（pH7.4） 67.4ml水
充分混合并保持冰。
1 M蔗糖
对于100毫升的缓冲区
42.7ml 80％蔗糖 0.1ml的1M MgCl 2溶液 0.5ml的1M Tris-HCl缓冲液（pH7.4） 56.7ml水
充分混合并保持冰。
2.33 M蔗糖
对于100毫升的缓冲区
99.4ml 80％蔗糖 0.1ml的1M MgCl 2溶液 0.5ml的1M Tris-HCl缓冲液（pH7.4）充分混合并保持冰。

参考文献

Chernyshova，Y.，Leshchyns'ka，I.，Hsu，S.C.，Schachner，M.and Sytnyk，V。（2011）。神经细胞粘附分子促进FGFR依赖性磷酸化和膜靶向的exocyst复合物诱导胞吐生长锥。 J Neurosci 31（10）：3522-3535。
Leshchyns'ka，I.，Sytnyk，V.，Morrow，J.S。和Schachner，M。（2003）。神经细胞粘附分子（NCAM）与PKCbeta2通过betaI血影的关联牵连NCAM介导的神经突生长。 J Cell Biol 161（3）：625-639
Li，S.，Leshchyns'ka，I.，Chernyshova，Y.，Schachner，M。和Sytnyk，V。（2013）。神经细胞粘附分子（NCAM）通过p21激活的激酶1（Pak1）结合并发出信号，。 J Neurosci 33（2）：790-803。
Pfenninger，K.H.，Ellis，L.，Johnson，M.P.，Friedman，L.B.and Somlo，S。（1983）。从胎鼠大脑分离的神经生长锥：亚细胞分离和表征。 35（2 Pt 1）：573-584。
Westphal，D.，Sytnyk，V.，Schachner，M。和Leshchyns'ka，I.（2010）。神经细胞粘附分子（NCAM）在神经元细胞表面的聚类诱导胱天蛋白酶-8和 -3依赖性的变化所需的NCAM介导的神经突生长。 J Biol Chem 285（53）：42046-42057