材料和试剂

Optiprep（Optiprep）是一种60％的碘克沙醇在水中的溶液，密度= 1.32g/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：079K1726）
氯化钠（NaCl）
Tris盐酸（Tris-HCl）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：ED255）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T-8532）
甲醇/氯仿
裂解缓冲液（见配方）
渐变缓冲区（参见配方）

设备

丸粒杵（Sigma-Aldrich，目录号：Z359963-1EA）
Sorvall WX90超速离心机（Thermo Fisher Scientific，目录号：46901）
Sorvall TH-641旋转叶片转子（Thermo Fisher Scientific，目录号：54295）
超速离心管：Beckman Coulter 开顶Ultra-ClearTM管（尺寸：14×89mm，标称体积：12ml）（Beckman Coulter ，目录号：344059 ）
1 ml移液器
Western印迹装置

程序

提取适当的组织匀浆在冰上的冷裂解缓冲液（总蛋白：1毫克在1毫升）2小时。用杵在微量离心管中手动破碎软组织（或细胞沉淀）。杵末端与1.5毫升微管良好配合，轴允许温和的手动来回旋转。
组合渐变
1. 立即准备所有溶液，并保持在冰上。
2. 在超速离心管的底部装载提取物（3ml，在40％Optiprep中），向裂解物中非常缓慢地加入6ml 30％Optiprep，然后加入非常缓慢地将2.5ml 5％Optiprep注射到30％Optiprep上。
  注意：重要的是避免混合接口。一个好的方法是让移液管吸头几乎不接触表面，并缓慢地覆盖溶液，同时沿管的侧面提起吸头。
确保管（包括桶和盖）已平衡。将管子放在Sorvall TH-641转子的桶中，预冷却在4°C，并将盖子拧在桶上。在4℃下以100,000xg离心24小时。
分析渐变
1. 通过使用自动1ml移液管从管的顶部缓慢和缓慢吸出来收集级分（1ml），确保移液管的尖端跟随降低的半月板。筏应存在于低密度部分2至4中，这是30和5％密度之间的界面。
2. 通过甲醇/氯仿方法沉淀300μl的等同物，并处理用于Western印迹。所述级分可以在-80℃下储存长达6个月。用于降水的协议描述在Aboulaich（2011）中。 br />
3. 总是检查在梯度中的筏标记的分布，以确认离心已经实现令人满意的分辨率和筏的恢复，已显示富含脂筏的Flotillin-1是最广泛使用的。对于脑组织，我们使用朊病毒蛋白，它也存在于脂筏中

食谱

裂解缓冲液
150mM NaCl 25mM Tris-HCl（pH7.4） 5 mM EDTA
1％Triton X-100 过滤灭菌并保持在4°C
渐变缓冲区
150mM NaCl 25mM Tris-HCl（pH7.4） 5 mM EDTA
过滤灭菌并保持在4°C

致谢

该协议改编自Lemaire-Vieille等人（2013）。

参考文献

Aboulaich，N。（2011）。从含洗涤剂的样品中沉淀蛋白。生物协议 1（5 ）：e40。
Lemaire-Vieille，C.，Bailly，Y.，Erlich，P.，Loeuillet，C.，Brocard，J.，Haeberle，AM，Bombarde，G.，Rak，C.，Demais，V.，Dumestre-Perard， C.，Gagnon，J。和Cesbron，JY（2013）。在表达嵌合PrP-Dpl蛋白的小鼠中具有小脑损伤的共济失调。 Neurosci 33（4）：1391-1399。
Persaud-Sawin，D.A.，Lightcap，S。和Harry，G.J。（2009）。通过无洗涤剂方法从小鼠脑组织中分离筏。 J Lipid Res 50（4）：759-767。