材料和试剂

细菌菌株（变异链球菌UA159野生型菌株或其他变异链球菌菌株）
Todd-Hewitt肉汤（BD Biosciences）
酵母提取物（BioShop）
Tris碱
NaCl
十二烷基硫酸钠（SDS）
Triton X-100
KOH
MgCl 2
甘氨酸
甘油
溴酚蓝
亚甲蓝
40％丙烯酰胺/双溶液（37.5:1丙烯酰胺：双丙烯酰胺）（BioShop）
过硫酸铵（Sigma-Aldrich）
TEMED（BioBasic，Inc。）
乙醇
异丙醇
dH 2 2 O
过滤纸
Precision Plus蛋白质预染色标准品（Bio-Rad Laboratories）
THYE汤（见食谱）
20mM Tris，100mM NaCl（pH7.4）（见Recipes）
1.5 M Tris（pH 8.8）（参见配方）
0.5 M Tris（pH 6.8）（参见配方）
SDS-PAGE加载缓冲液（参见配方）
Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液（参见配方）
Zymogram复性缓冲液（见配方）
染色溶液（见配方）
10％分离凝胶溶液（见配方）
4％堆积胶溶液（见配方）

设备

15毫升规范管
烧瓶
1.5 ml微量离心管
冷冻离心机
冷藏微量离心机
CO <2>孵化器
分光光度计
一次性塑料比色杯
蛋白质微型凝胶盒
加热块模块
电源
轨道振动器
37°C温度室

程序

制备掺入凝胶中的细菌基质
1. 开始5毫升的培养。 mutans UA159野生型菌株（或其它变异链球菌菌株）在THYE肉汤中转移到15ml规范管中，并在37℃下在含有5％CO 2的空气中温育过夜， sub> 2 。
2. 将具有1％过夜预培养物的300ml新鲜THYE肉汤接种到500ml烧瓶中。
3. 在37℃下在具有5％CO 2的空气中静置培养物直至达到600nm（OD 600）的光密度为0.2。
4. 通过在4℃下以10,000×g离心10分钟收获细胞。
5. 使用5ml的20mM Tris，100mM NaCl缓冲液（pH 7.4）洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬在1.0ml的1.5M Tris缓冲液（pH 8.8）中。
6. 保持细胞在-20°C，直到使用。
细菌全细胞提取物的制备
1. 开始5ml过夜培养的S. mutans UA159野生型菌株（或其它变异链球菌菌株）在THYE肉汤中转移到15ml规范管中，并在37℃下在具有5％CO _{> 2}。在研究中缺乏肽聚糖水解酶的突变体菌株的全细胞提取物也可以作为阴性对照同时分析以确认观察到的水解带的特异性。
2. 将10ml新鲜THYE肉汤与1％的过夜预培养物接种到15ml经典管中。
3. 在37℃下在具有5％CO 2的空气中静置培养物直至达到所需的OD 600。如果目标肽聚糖水解酶的表达谱是未知的，我们建议收获细胞在不同的光密度对应的生长早期对数，中对数，早稳定和晚稳定期。
4. 通过在4℃下以10,000×g离心10分钟收获细胞。
5. 保持细胞沉淀-20℃，直到使用。
6. 重悬细胞沉淀在20μl的新鲜制备的SDS-PAGE加载缓冲液中。
7. 将样品在95℃下加热10分钟。保持样品在冰上，直到加载
酶谱凝胶的制备
1. 用乙醇清洁玻璃板，隔板和梳子，使用前完全干燥。按照制造商的说明装配凝胶盒。
2. 制备10％分离胶溶液（见配方9）。
3. 将分离的凝胶溶液（每个小凝胶约3.8ml）转移到玻璃板之间的浇铸室中，并在梳子就位时填充到梳子底部下方约0.7cm处。
4. 在聚合之前向凝胶顶部加入一小层异丙醇以使凝胶水平变直。一旦凝胶聚合，通过用dH 2 O 2洗涤几次除去异丙醇层，并用滤纸干燥。
5. 制备4％堆积胶溶液（见配方10）。
6. 将堆积的凝胶溶液（约2.5ml /小凝胶）倒在分离凝胶顶部，直到空间充满，然后插入适当的梳子。一旦凝胶聚合，小心取出梳子。
7. 从铸造台上取下凝胶盒，并将其放置在制造商推荐的电极组件中。
8. 将Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液倒入凝胶盒之间的铸造框架的开口中。加入足够的缓冲液填充凝胶的孔。也填充框架外部的区域。
9. 将样品（从第II节，步骤B-7）装入每个孔以及5μl的Precision Plus蛋白质预染色标准品。
10. 将电泳槽连接到电源。在125-200伏之间的恒定电压下运行凝胶，直到染料前沿接近凝胶底部
肽聚糖水解酶检测
1. 从电泳室中取出凝胶，使凝胶剥离并轻轻地落入容器中。在室温下在持续搅拌下在100ml dH 2 O中洗涤凝胶两次30分钟。
2. 在室温下在持续搅拌下将凝胶在100ml的酶谱复性缓冲液中孵育30分钟。该步骤是复性肽聚糖水解酶所必需的。
3. 用新鲜的酶谱复性缓冲液替换酶谱复性缓冲液，并在恒温搅拌下在37℃下在恒温箱中孵育凝胶，直到出现清晰的水解带，通常在16小时和48小时之间。蛋白水解活性表现为针对白色背景的清晰条带。
4. 任选染色步骤：倾析缓冲液并加入100 ml染色溶液，并在室温下在15分钟至2小时之间的恒定搅拌下温育凝胶。没有染色的区域指示裂解（图1）。蛋白水解活性表现为针对蓝色背景的清晰条带。
  
  图1.在亚甲基蓝染色后的酶谱活性凝胶。将突变体的热灭活细胞用作底物，并掺入10 ％SDS-PAGE凝胶。（1）分子大小标记（Precision Plus Protein Prestained Standards）。（2）S的全细胞提取物。 mutans UA159野生型菌株。观察到的两个水解带（箭头）对应于AtlA自溶素的未处理（上）和处理（下）形式。

食谱

THYE汤液
将15g Todd-Hewitt和1.5g酵母提取物溶解在400ml dH 2 O中。
一旦溶解，使用dH 2 O·v/v使最终体积达到500ml 在120℃下高压灭菌20分钟
在室温下贮存
20mM Tris，100mM NaCl缓冲液（pH7.4）将2.42g Tris碱和5.84g NaCl溶于800ml dH 2 O中。
一旦溶解，将pH调节至7.4，然后用dH 2 O使最终体积达到1L。
存储在4°C
1.5M Tris pH8.8缓冲液
将181.71g Tris碱溶解在800ml dH 2 O中一旦溶解，将pH调节至8.8，然后用dH 2 O升至1L的最终体积。
存储在4°C
0.5M Tris pH 6.8缓冲液
将60.57g Tris碱溶解在600ml dH 2 O中一旦溶解，将pH调节至6.8，然后用dH 2 O使最终体积达到1L。
存储在4°C
SDS-PAGE上样缓冲液（0.25M Tris pH6.8,2％SDS，10％甘油，溴酚蓝）将0.3g Tris碱，0.2g SDS，1.0ml甘油和痕量溴酚蓝溶于7ml dH 2 O中。
一旦溶解，使用dH 2 O，使最终体积达到10ml
Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液（25mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％SDS）将3.03g Tris碱，14.4g甘氨酸和1g SDS溶于800ml dH 2 O中。
一旦溶解，用dH 2 O 2/v升至最终体积为1L 存储在4°C
Zymogram复性缓冲液（20mM Tris，50mM NaCl，20mM MgCl 2，0.5％Triton X-100，pH7.4）
在800ml dH 2 O中溶解2.42g Tris碱，2.92g NaCl和4.06g MgCl 2。将pH调节至7.4
加入5ml Triton X-100，用dH 2 O使最终体积达到1L。
存储在4°C
染色溶液（0.1％亚甲蓝，0.01％KOH）将0.1g亚甲基蓝和0.01g KOH溶于100ml dH 2 O中。
在室温下贮存
10％分离凝胶溶液
将以下试剂混合在干净的烧瓶中（4个小凝胶的总体积）：
7.4ml dH 2 O 2 / 3.7ml 40％丙烯酰胺/bis
将4ml细菌底物（来自A部分，步骤A-6）在刚使用前煮沸10分钟
100μl10％SDS
50μl10％过硫酸铵
5μlTEMED
4％堆积胶溶液
将以下试剂混合在干净的烧瓶中（4个小凝胶的总体积）：
6毫升dH 2 O 2 / 2.5ml 0.5M Tris（pH 6.8）
1.0ml 40％丙烯酰胺/bis
100μl10％SDS
100μl10％过硫酸铵
25μlTEMED

参考文献

Berg，K.H.，Ohnstad，H.S。和Havarstein，L.S.（2012）。 LytF，一种在链球菌属中的新型竞争性调节的木霉素水解酶。 J Bacteriol 194（3）：627-635。
Dufour，D。和Lévesque，C.M。（2013）。由群体感应肽诱导的变异链球菌的细胞死亡通过 a conserved streptococcal autolysin。 J Bacteriol 195（1）：105-114。