材料和试剂

人胚胎肾HEK293细胞（Health Protection Agency Culture Collections，目录号：96121229）
载体：含有感兴趣的cDNA（即pcDNA3 + SCN5A）的哺乳动物表达载体
Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）（Sigma-Aldrich，目录号：D6546）
胎牛血清（Sigma-Aldrich，目录号：F4135）
青霉素 - 链霉亲和素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-122）
GlutaMAX ^TM（Life Technologies，Gibco ，目录号：35050-038）
0.05％胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，Gibco ，目录号：25300-062）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（Sigma-Aldrich，目录号：D8662）
GeneCellin ^TM转染试剂（BioCellChallenge，目录号：GC-1000）
Opti-MEM Reduced Serum Media + GlutaMAX ^TM（Life Technologies，Gibco ，目录号：31985-062）
酒吧粘蜡（Cera de Reus，目录号：25005001）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich）
氯化铯（CsCl）（Sigma-Aldrich）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich）
N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）（Sigma-Aldrich）
乙二醇 - 双（2-氨基乙基醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich）
腺苷5'-三磷酸镁盐（ATP-Mg 2+）（Sigma-Aldrich）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich）
氢氧化铯（CsOH）（Sigma-Aldrich）
葡萄糖（Sigma-Aldrich）
浴溶液（见配方）
移液器溶液（见配方）

设备

用于落射荧光的倒置显微镜Nikon Eclipse Ti（Nikon Instruments Inc.）
玻璃毛细管PC-10 Puller（Narishige International USA Inc.）
微型操纵器MP-285（Sutter Instrument Co.）
蒸气压渗透压计VAPOR 5520（Wescor Inc.）
Axopatch 200B电容反馈贴片钳放大器（Molecular Devices）
Axon Digidata 1440A数据采集系统（Molecular Devices）
CO 2 2培养箱
Nunclon 细胞培养皿35×10mm（Sigma-Aldrich，目录号：D7804）
玻璃毛细管（Brand GmbH + CO KG，目录号：7493-21）

软件

pCLAMP 10.2电生理学数据采集和分析软件（Molecular Devices）
OriginPro 8软件（OriginLab公司）

程序

细胞培养和转染
1. 在转染前一天，在35mm皿中平板HEK293细胞，其密度将在24小时后导致70％汇合（这是2.1×10 5个细胞，但其可以根据细胞的多快而变化线生长），并在37℃下在补充有10％胎牛血清，1％青霉素 - 链霉素和1％GlutaMAX TM的DMEM中的CO 2培养箱中维持。
2. 使用200μlOpti-MEM 培养基，3μg（总共）感兴趣的载体和4μlGeneCellin TM混合物对每个35mm培养皿的HEK293细胞进行转染转染试剂。包含携带编码荧光蛋白的cDNA的载体将允许鉴定转染的细胞。
  注意：其他转染试剂和方法已成功用于转染钠通道。
3. 转染后24小时，用1.5ml DPBS洗涤每个皿，然后加入0.2ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA，并在37℃孵育2分钟，细胞应该看起来彼此分离，加入1.5ml的DMEM到盘，用细尖移液管分散，并且在具有1.5ml培养基的新培养皿中培养板200-300μl。
  注意：您应该获取单个单元格进行录制。
膜片钳方法（转染后48小时）
1. 从玻璃毛细管吸取吸管，并用熔化的牙科蜡精细涂覆尖端（小心不要堵塞尖端孔）。填充移液管溶液时，其电阻应在2至4MΩ之间
2. 从您将使用的转染细胞培养皿中取出DMEM，用Bath溶液（总共约3ml）冲洗细胞两次后，用相同溶液填充约三分之一的高度。
3. 选择您将从单个荧光细胞记录的单元格。
4. 用移液管溶液填充移液器，并将其放在电极夹中。降低移液管将其放入Bath溶液中。补偿偏移后，在远程显微操纵器的帮助下，将移液器靠近选定的细胞，形成高电阻细胞附着密封。
5. 一旦形成密封并且建立了整个电池构造，就补偿80-90％的串联电阻。
6. 等待五分钟后开始记录。这允许细胞内容物与移液管溶液平衡
7. 要进行采集，请将滤波器设置为5 kHz，采样率设置为20-25 kHz
钠测量方案
1. 宏观钠电流：从-120mV的保持电位通过50ms去极化步骤（以5mV的增量从-80至+ 80mV）引发电流。
2. 稳态失活（h∞）：电流以-20 mV脉冲（20 ms），50 ms前脉冲至不同电位（-140至+5 mV，以5 mV为增量）测量。
3. 从失活中恢复：电流由-20mV，20ms脉冲（P2）引发，之前是从-120mV的保持电位去极化预脉冲至-20mV（P1）的50ms，随后是超极化脉冲到-120mV的增加持续时间（1-100ms）。
4. 慢速灭活：双脉冲方案1：在20ms（P2）期间使用测试脉冲测量电流至-20mV，在去极化脉冲之前是从-120mV至-20mV（P1）的持续时间增加（10-100ms以10ms的增量），随后在20ms期间超极化脉冲至-120mV，以去除快速失活。双脉冲协议2：该协议与前一个协议相同，除了第一去极化脉冲到-20（P1）的持续时间以100ms为增量从100到2,000ms。
钠测量分析（pClamp 10.2和OriginPro 8软件）
1. 电流密度 - 电压（pA/pF）：在施加的不同电压下的测量峰值电流由单元电容归一化。
2. 活化曲线：通过将在每个电位获得的峰值电流除以驱动力（ IV），从电流 - 密度关系（ IV ）获得全细胞电导> VE _ion ）。这些值标准化为最大电导（ G ），并对每个电压作图。数据拟合到形式为 G = G _max /（1 + exp [ em> 是施加的电位， _1/2是半个通道的电压激活，并且 k 是斜率因子。
3. 停用时间常数：时间常数（ t ）， t _{通过将用宏观钠电流方案引出的电流拟合为二阶指数函数，获得快速。在某些电压下，当电流太快或太小时，不可能拟合二阶指数。在这种情况下，使用一阶指数。被分析以获得时间常数的区域包括从电流的峰值到电流已经达到接近零的平台期的点。和 t _快速}
4. 稳态失活曲线：峰值电流幅度（ I ）被归一化为最大峰值电流幅度（ _max）。来自测试脉冲的 I / I _max值与预脉冲期间的电压作图。实验数据被拟合到形式为的发射波尔兹曼方程中：I = I _max /（1 + exp [ V ）/ k ]），其中是施加的电压，/em> 1/2是在一半的通道被去激活时的电压，并且 k 是玻尔兹曼常数。
5. 从失活中恢复：恢复电流值通过将P2的峰值电流除以P1处的峰值电流获得。 P2/P1比率对恢复间隔时间作图。从失活曲线恢复拟合单指数函数以获得时间常数（ t ）。
6. 慢失活：在P2和P1测量峰值电流。将P2/P1比值对去极化脉冲间隔时间作图。将慢失活曲线拟合为单指数函数获得慢灭活常数（ t ）。

食谱

浴溶液
140mM NaCl 3 mM KCl
10 mM HEPES
1.8mM CaCl 2 v/v 1.2mM MgCl 2·h/v 用NaOH将pH调节至7.4 重量摩尔渗透压浓度通过将葡萄糖加入到约325mOsm来调节。
移液器溶液
130 mM CsCl
1 mM EGTA
10 mM HEPES
10mM NaCl 2mM ATP-Mg ^{2 +}
用CsOH将pH调节至7.2 重量摩尔渗透压浓度通过加入葡萄糖至约308mOsm来调节注意：移液器和浴溶液之间渗透压的差异应该在5％左右。

致谢

该协议改编自Riuro等人（2013）和Tarradas等人（2013）。

参考文献

Riuró，H.，Beltran-Alvarez，P.，Tarradas，A.，Selga，E.，Campuzano，O.，Vergés，M.，Pagans，S.，Iglesias，A.，Brugada，J.and Brugada，P 。（2013）。钠通道β2亚基中的错义突变显示SCN2B < em>作为Brugada综合征的新候选基因。 Hum Mutat 34（7）：961-966。
Tarradas，A.，Selga，E.，Beltran-Alvarez，P.，Perez-Serra，A.，Riuro，H.，Pico，F.，Iglesias，A.，Campuzano，O.，Castro-Urda，，Fernandez-Lozano，I.，Perez，GJ，Scornik，FS和Brugada，R。（2013）。心脏钠通道孔隙区域的新型错义突变I890T引起Brugada综合征。 a> PLoS One 8（1）：e53220。

附加建议书目

Sakmann，Bert和Neher，Erwin。（1995）。单通道记录。 Springer-Verlag，2 ^{nd Edition。纽约。}
Molleman，Areles（2008年重印）。补丁夹。膜片钳电生理入门指南。 John Wiley and Sons Ltd. England：West Sussex。