材料和试剂

小鼠
Avertin（Sigma-Aldrich，目录号：T48402）
PBS（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
RPMI-1640（Sigma-Aldrich，目录号：R8758）
FACS缓冲液（PBS/0.5％BSA）
Diff-Quick染色试剂盒（Dade Behring，目录号：B4132-1A）
单细胞学漏斗（Biomedical Polymers，Inc.，目录号：BMP-CYTO-S50）
Superfrost载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：22-034-979）
Liberase Blendzyme（F.Hoffmann-La Roche，目录号：05401119001）
DNase（F.Hoffmann-La Roche，目录号：10104159001）
台盼蓝（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：15250-061）
小鼠Fc嵌段（BD Biosciences，Pharmingen ^TM，目录号：553141）
用于T细胞的抗体（CD3 ⁺）
用于B细胞的抗体（B220 ⁺）
嗜酸性粒细胞抗体（Siglec-F ⁺ CD11c ^-）
用于肺泡巨噬细胞的抗体（AMs，Siglec-F ^{+ CD11c} CD11b ^int F4/80 ⁺）
间质巨噬细胞的抗体（Ims，Siglec-F ^{-CD11c ^{-CD11b ⁺ F4/80 ⁺）}}
中性粒细胞抗体（Siglec-F ^- CD11c ^- CD11b ⁺ Ly6G ⁺）
树突状细胞（DC）的抗体（Siglec-F ^{-CD11c ^hi MHCII ^hi）}
红细胞裂解缓冲液（参见配方）
组织消化溶液（参见配方）

设备

1 ml，3 ml和10 ml无菌注射器
21号灌洗管
21号无菌针
棉线40号
50ml烧瓶中
15 ml和50 ml锥形管
微管
100微米细胞滤器（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352360）
血细胞计数器
离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra ^{TM 6R）}
Cytospin细胞离心机（Thermo Fisher Scientific/Shandon，型号：A7830002）
显微镜
BD LSR II流式细胞仪
3-way Stopcocks（Bio-Rad Laboratories，型号：732-8103）
磁力搅拌棒（VWR International，型号：58949-006）
多位置磁力搅拌器（VWR International，型号：12621-042）

程序

通过腹膜内注射1ml 2.5％Avertin的PBS麻醉小鼠
使用剪刀暴露胸腔和颈部。解剖组织从颈部暴露气管
继续打开隔膜切割肋骨，暴露心脏和肺。小心不要刺破心脏或肺。
使用镊子在气管下滑动1英寸长的螺纹
在气管中做一个小切口，允许21规格的灌洗管通过气管。气管近端与气管切口之间的距离为2-3mm。
注意：不要一直割伤气管。
切割21号管的1-1.5英寸部分，小心地将21号针穿入管中。将管插入气管，并将管线缠绕在气管中的管周围
使用"输入"3毫升注射器通过三通旋塞，缓慢注射1毫升冷PBS的0.1毫米EDTA到肺中：注意肺膨胀，不要过度充气。
收集约1毫升BAL液（BALF）从肺，使用"输出"3毫升注射器在冰上的微管中。
重复步骤7-8每个动物3次洗涤，每次使用1ml PBS/0.1mM EDTA通过3通活塞。从针头取出注射器，注射回收的灌洗液在冰上15毫升falcon管注意：对于肺组织消化，请转到第22步。
离心含有〜1 ml BAL的微管，在1,500 rpm下制动5分钟。
吸管上清液（BALF）从这些管放入新鲜的微管，存储在-80°C，直到准备好进行ELISA。
吸取500微升PBS重悬细胞沉淀在离心微管，并添加所有细胞回到15毫升锥形管。
离心15毫升锥形管在1,500 rpm 5分钟与制动和重悬细胞与1毫升红细胞裂解缓冲液，并保持在冰上5分钟。
以1,500 rpm离心细胞5分钟。
弃去上清液并将BAL细胞重悬于500μlRPMI或FACS缓冲液中
加入50微升台盼蓝到50微升保存的等分试样，混匀，使用血细胞计数细胞。计算并记录细胞浓度。
计算每个幻灯片0.5-1 x 10 ⁵个单元所需的体积
通过用300μlPBS旋转在玻璃载玻片（可重复使用）上以600rpm离心5分钟预湿润细胞离心涂布漏斗。
准备含有0.5-1×10 5个细胞的微量管，总体积为300μl。旋转BAL细胞到新鲜的标签玻璃载玻片上，在600 rpm下10分钟
从细胞离心涂片装置中取出所有载玻片，并允许空气干燥至少2小时。
干燥后，使用Diff-Quick染色试剂盒染色载玻片，如下：
25秒固定溶液
在溶液I中为15秒
溶液II中为15秒
用蒸馏水冲洗载玻片。
使用油浸镜在100倍放大倍数下在显微镜下进行微分细胞计数（图1）

图1.用Diff-Quick染色的cytospun BAL细胞的照片。（A）对照BAL; （B）来自哮喘小鼠的BAL。
以下方案用于肺组织消化。在灌洗后，立即使用填充有5ml PBS的10ml注射器灌注肺血管床。在左心室做一个小切口，并连接一个21 G针和插入针到右心室。精确灌注会导致颜色变为白色。
转移肺叶到培养皿，并使用剃刀切割成小的可消化的碎片。
将接地的肺组织转移到含有20ml /肺组织消化溶液和磁力搅拌棒的50ml烧瓶中。孵育，以常规速度，在37℃下搅拌30-45分钟。
注意：这可以在37℃的培养箱中进行。
通过重复抽吸通过10ml注射器分散悬浮液，转移到50ml锥形管中，并在4℃下以1,500rpm离心5分钟。
通过悬浮在红细胞裂解缓冲液中在室温下裂解剩余的红细胞2分钟。用10ml冷PBS/0.5％BSA洗涤细胞并在4℃以1,500rpm离心5分钟。
用10ml冷PBS/0.5％BSA洗涤细胞两次，并通过100μm细胞过滤器过滤。
在FACS缓冲液中在50μl1：200Fc块中重悬1百万个细胞，并在冰上孵育10分钟。
用1ml PBS/0.5％BSA洗涤细胞，并在4℃下旋转细胞5分钟
用抗体（在FACS缓冲液中1:100）弃去上清液和染色细胞，并在冰上孵育30分钟。
注意：所有荧光染料偶联的mAb购自eBioscience或Biolegend。
用1ml PBS/0.5％BSA洗涤细胞，并在4℃下旋转细胞5分钟
重悬细胞在500μlPBS/0.5％BSA，并使用BD LSR II流式细胞仪分析细胞（图2）。

图2.肺消化细胞的门控策略。此策略也适用于BAL单元格。

食谱

红细胞裂解缓冲液
NH 4 Cl 16.4g
KHCO ₃ 2 g
EDTA 0.5M400μl
2 L ddH 2 O 2/b 用HCl滴定至pH 7.2-7.4
组织消化溶液
无血清RPMI 1640
0.13mg/ml Liberase Blendzyme
20 U/ml DNase

致谢

我们感谢齐格勒实验室的成员进行讨论。

参考文献

Han，H.，Headley，M.B.，Xu，W.，Comeau，M.R.，Zhou，B.and Ziegler，S.F。胸腺基质淋巴细胞生成素放大交替激活的巨噬细胞的分化。/em> 190（3）：904-912。