材料和试剂

早期四龄幼虫幼虫
女性蚊子
模板DNA
Fisherfinest * Premium超厚磨砂显微镜幻灯片（双面磨砂涂层）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-544-6）
Fisherfinest * Premium Cover Glasses（22 x 22 mm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-544-10）
50％丙酸的水溶液
剃刀刀片
液氮
乙醇，分子生物学等级
带盖的显微镜载玻片染色瓶
随机引物DNA标记试剂盒（Roche Applied Science，目录号：11004760001）
随机引物DNA标记系统（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：18187-013）
甲酰胺（超纯）（Fisher Bioreagent，目录号：BP228-100）
来自明串珠菌的硫酸葡聚糖钠盐。（Sigma-Aldrich，目录号：D8906）
Prolong Gold抗消色剂（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：P36930）
Cy3-dUTP（GE Healthcare，目录号：PA53022）
Cy5-dUTP（GE Healthcare，目录号：PA55022）
YOYO碘化物（491/509）-1mM DMSO溶液（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：Y3601）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
DNA聚合酶I（Fermentas，目录号：EP0041）
DNase I（Fermentas，目录号：EN0521）
QIAquick 凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28104）
Carnoy的解决方案（见配方）
20x SSC（请参阅配方）
3 M NaAC（见配方）
1x PBS（请参阅配方）
杂交缓冲液（参见配方）

设备

1.5 ml微量离心管
镊子
一次性转移移液器
解剖针
研究立体显微镜（Leica，型号：VA-OM-E194-354）
具有10x，20x，40x和100x物镜的相差化合物显微镜
热循环仪
Vacufuge 真空浓缩器（Eppendorf，型号：022820001）
孵化器
水浴
Vortexer
共焦显微镜或荧光显微镜

程序

Polytene染色体制备
A-1 唾液腺染色体制备
1. 保存早期四龄幼虫在Carnoy的解决方案，并保持在-20°C。
2. 用一把镊子从小瓶中取出一个四龄幼虫，并将其置于无背衬的显微镜载玻片上，向上，然后立即将一滴新鲜的卡诺溶液放在其上（图1a）。
  注意：当需要时，继续加入Carnoy's溶液滴以防止干燥，直到将50％丙酸浸渍到腺体上。
  在用一个解剖针牢固地握住幼虫的同时，用另一个针轻轻地将头部远离胸部（图1b）。从正好在角质层下面的胸部的中间后部插入针，并且轻轻地向前移动以沿着背中线断开胸部角质层（图1c）。小心地打开胸部，并从连接组织分离唾液腺（图1d和1e）。从幻灯片中取出尸体和其他组织，并将一滴新鲜的50％丙酸放在腺体上（图1f）。
  
  图1.在第4代晚期幼虫中的唾液腺的解剖。西安
3. 用无尘盖玻片盖腺，并离开他们约5分钟。 5分钟后，将一张滤纸放在盖玻片上，用手指保持四个边缘静止。轻轻点击用铅笔橡皮擦释放多烯染色体从唾液腺。
4. 使用相差显微镜检查聚苯染色体的条带模式和扩散。
5. 将具有良好染色体制剂的载玻片置于在室底部具有4×SSC的潮湿室中，在60℃下15-20分钟。加热后，将载玻片在4℃下过夜或直到将载玻片浸没在液氮中。加热可以在Thermobrite机器上进行，吸收条带浸泡在蒸馏水中。
  注意：如果在4°C长时间放置，载玻片可能会变干。不建议将它们在4°C下放置超过隔夜。
6. 用镊子或戴手套的手握住载玻片的一个角，将染色体制备物浸入液氮中，使得盖玻片完全浸没。在液氮中保持载玻片，直到鼓泡停止（通常10-15秒）。拿出液氮，立即用刀片从一个角落去除盖玻片。当试图取下盖玻片时，有时有助于将载玻片放在平坦的表面上。将载玻片置于带有预冷的50％乙醇（-20℃）的玻璃罐中并在4℃保持至少2小时。
7. 在玻璃罐中的制剂用70％的乙醇系列和90％在4℃下各自5分钟，然后在室温下100％乙醇5分钟。空气干燥，并将载玻片保持在载玻片盒中，直到准备好用于原位杂交（图2）。
  注意：保护免受灰尘和碎屑影响的幻灯片可以在制作后至少一年内用于FISH。
  
  图2.来自from的唾液腺的多烯染色体。 sinensis
A-2 来自卵巢的染色体制备
1. 在2次或3次血液喂养（Christophers'III期）后18-33小时从半妊娠女性解剖蚊子的卵巢保持4-5卵巢在小瓶与1毫升Carnoy的溶液。在室温下固定卵巢24小时后，将小瓶转移至-20°C储存注意：女性应该进行血液喂养，并在再次进行供血之前至少产下一次卵，并切除卵巢进行染色体制备。
2. 为了制备染色体，用一对镊子（或移液管）从小瓶中取出一个卵巢，并将其放入显微镜载玻片上的一滴Carnoy's溶液中。仔细去除组织，气管和血液后，迅速将卵泡从一个卵巢分离成2-4片。可以从一个卵巢制备多达四个制剂。
  注意：在解剖时，卵巢不应该被允许干燥。当需要时，继续加入Carnoy's溶液滴以防止卵巢干燥。
3. 在4-8 *显微镜载玻片上，在单独的载玻片上加入每片分裂的卵巢和一滴50％丙酸。让卵巢的部分休息在丙酸约5分钟，直到毛囊变清澈，膨胀到原来的大小的两倍。
  *您需要的幻灯片数量取决于每个卵巢分成多少块。
4. 对于每个幻灯片，使用解剖显微镜分离清除的卵泡彼此和幻灯片上的任何其他组织或碎片。通过用一块纸巾擦拭去除组织和碎片，并将新鲜的50％丙酸滴加到分离的卵泡中。
5. 与"唾液腺染色体准备"中的步骤3-7相同。

探头准备和标签
如果使用PCR产物作为探针，使用QIAquick凝胶提取试剂盒或QIAquick PCR纯化试剂盒从琼脂糖凝胶或PCR反应中纯化PCR产物。也可以使用除去过量核苷酸的类似试剂盒。然而，当使用试剂盒时，将DNA溶解在双蒸水中，而不是最终步骤中建议的洗脱缓冲液。
B-1 用于短于1kb的片段的随机引物标记方案（来自Roche的随机引物DNA标记试剂盒

将25 ng模板DNA加入双蒸水中，至微量离心管中的最终体积为13.5μl
通过在95℃下在沸水浴中加热10分钟使DNA变性，并在冰浴中快速冷却。

在冰上加入新鲜变性的探针：

dGTP，1.0mM	1微升
dCTP，1.0mM	1微升
dATP，1.0mM	1微升
反应混合物（小瓶6）	2微升
Klenow酶（Vial 7）	1微升
Cy3或Cy5-dUTP，1.0mM	0.5μl

混合并短暂离心。

在37℃下孵育1小时至20小时（过夜）
加入1/10体积的3M NaAC和2.5-3体积的100％乙醇。并通过翻转管混合。保持在-80°C或-20°C至少3小时或直到需要探针杂交。如果需要，探针可以留在冷冻箱中长期储存

B-2 用于短于1kb的片段的随机引物标记方案（来自Invitrogen的Random Primers DNA Labeling System）

混合1微升DNA和10微升2.5x随机引物溶液和2.5微升无菌水井
在沸水或加热块中变性5分钟，立即在冰上冷却
加入1.25μl1.0mM dNTP混合物（无标记的dNTP），8.75μl水和1μlKlenow片段，轻轻混合。
每管加入0.5μlCy3或Cy5-dUTP荧光核苷酸，完成后，必须立即覆盖管以防止光照。充分混合并在37℃孵育1.5小时
与第II-1节"用于短于1kb的片段的随机引物标记方案（来自Roche的随机引物DNA标记试剂盒）"中的步骤5相同。

B-3对于长于1kb（1-150kb）的片段的翻译标记

在冰上制备以下反应混合物：

DNA聚合酶I的10x缓冲液	5微升
1.0mM dATP，dCTP，dGTP和0.3mM dTTP混合物	5微升
新鲜稀释至0.02单位/μl的DNA酶	4μl**
DNA聚合酶I	1μl**
模板DNA	1微克
Cy3-或Cy5-dUTP	1微升
BSA稀释至0.5mg/ml	5微升
加水至最终体积50μl

注意：此协议可以按 1/2 缩小以容纳500 ng的模板DNA。
DNA酶I和DNA聚合酶I的最终浓度必须基于包括模板DNA的初始大小，模板DNA浓度和反应时间的因素进行优化。较大的模板大小和较大的模板浓度通常需要更多的DNase。

在15°C孵育混合物2-3小时。
在琼脂糖凝胶上运行3μl反应混合物以确定消化的片段的大小。片段应为100-600bp以获得最佳杂交结果。如果碎片仍然大于此值，在15℃下再孵育一段时间
为了终止反应并沉淀标记的探针，进行与B-2节"用于短于1kb的片段的随机引物标记方案"（来自Roche的随机引物DNA标记试剂盒）中的步骤5相同的操作。
注意：荧光标记的探针应该避光！在接下来的步骤中，即使没有明确说明，也要努力保护探头免受光照。

染色体固定
1. 如果载玻片超过两个月大，请执行步骤C-2和C-3。否则，请转到步骤C-4。
2. 将载玻片在1：3冰醋酸：甲醇中室温固定10分钟并风干
3. 脱水在100％乙醇中滑动10分钟，再次风干
4. 在室温下将载玻片浸入1x PBS中20分钟。
5. 将载玻片在室温下在4％多聚甲醛中固定1分钟。
  注意：多聚甲醛是危险的，应小心处理。避免在准备过程中呼吸气体或灰尘：处理时戴手套和其他PPE。多聚甲醛溶液不应倾倒在下水道。
6. 将载玻片在室温下通过50％，70％，90％，2x 100％的乙醇系列脱水，每次5分钟。
7. 空气干燥载玻片。
原位杂交
1. 在20,817×g离心标记的探针的管10分钟。小心地取出上清液，并抽空管子20分钟以干燥沉淀
2. 将干探针溶解于预热至37℃的杂交缓冲液中。用于溶解的杂交缓冲液的量取决于要溶解的DNA的总量。将1μgDNA溶于20-40μl温热的杂交缓冲液中
3. 在干净的微量离心管中，结合至少250ng的每个蓝色（Cy5标记的）和一个红色（Cy3标记的）探针。如果至少500ng的DNA杂交，原位杂交是有效的幻灯片。涡旋并短暂离心组合探头的管
4. 将上述制备的组合探针溶液转移到染色体制备载玻片上，并用22×22mm盖玻片盖上。用温和的压力除去任何大气泡。
5. 通过将载玻片置于Thermobrite机器上在90℃下10分钟来使靶标和探针DNA变性。 Thermobrite机器不需要潮湿。
6. 用橡胶胶水密封盖玻片的边缘。
7. 将载玻片转移到预热的湿室，在室底部用4×SSC，并在39℃下孵育用于种间（例如冈比亚 Stephensi染色体）或42℃用于内部杂交3-18小时（通常过夜）。
  注意：因为幻灯片上有荧光标记的探针，潮湿的室应该是不透光的。
洗涤
1. 使用镊子和盖玻片小心清除橡胶水泥
2. 在用铝箔覆盖的玻璃罐中，在种子之后在39℃下用1x SSC洗涤载玻片，或在50℃下在不摇动的情况下在42℃下在0.2×SSC中杂交20分钟后洗涤载玻片。
3. 在种子之后用1x SSC洗涤载玻片或在室温下在50ml不摇动的情况下在室内杂交20分钟后用0.2x SSC洗涤载玻片。
4. 稀释荧光染料YOYO-1 100倍在1×PBS中制成储备溶液。混合10μl的100x稀释的YOYO-1与90μl1×PBS的每个幻灯片，你想染色。 YOYO-1的工作溶液相对于原始浓度稀释1,000倍。
5. 在室温下在SSC中洗涤20分钟后，在1x PBS中漂洗载玻片，并在每个载玻片上加入100μl的YOYO-1 PBS。用石蜡膜覆盖。在室温下放置10分钟，在滑动盒内或某处暗处
6. 冲洗1 x PBS，加入10μlProlong Gold抗衰减试剂，将盖玻片放在载玻片上，并吹出气泡。保持在4°C的滑动盒。
信号检测
使用共聚焦或荧光显微镜检测信号，并将它们映射到按蚊蚊子的多染色体（图3）。

图3.来自An的卵巢护士细胞的聚丙烯染色体上的DNA探针的荧光原位杂交和作图。 stephensi

食谱

Carnoy溶液：甲醇：冰乙酸= 3：1
注意：Carnoy的溶液应该在良好的通风或通风橱中使用。使用Carnoy的溶液时，也应戴上手套，不应该在排水管下方处理。
1×PBS（1L）

NaCl
8.01克

KCl
0.20克

NaH 2 PO 4（无水）
1.15克

（无水的）。
0.20克
20x SSC（500ml）

氯化钠
87.5克

柠檬酸钠
44克

加入1N HCl至pH7.0
杂交缓冲液（2ml）

20x SSC
120微升

硫酸葡聚糖
0.2 g

甲酰胺
1.2 ml

水
580μl
3 M NaAC
将24.61g乙酸钠（无水）溶于100ml水中

致谢

该方案改编自以前发表的文章：Sharakhova等人（2010）和Kamali等人（2012）。我们感谢中国上海疾病预防控制中心提供一个中华按蚊菌群。这项工作得到中国国家自然科学基金会（31301877）AX和由国家卫生研究院（Bethesda，MD，美国）授予（5R21AI094289）到IVS的支持。 AP和IVS 部分由关键技术和应用科学研究所（ICTAS）和NSF奖0850198支持。

参考文献

Kamali，M.，Sharakhova，M.V.，Baricheva，E.，Karagodin，D.，Tu，Z.and Sharakhov，I.V。（2011）。亚洲疟疾蚊子微卫星标记和反转断点的综合染色体图，
。 J Hered 102（6）：719-726。
Kamali，M.，Xia，A.，Tu，Z.and Sharakhov，I.V。（2012）。新的染色体系统发育支持冈比亚疟疾疟疾蚊子的矢量能力的重复起源复杂。 PLoS Pathog 8（10）：e1002960。
Peery，A.，M.V.Sharakhova，Antonio-Nkondjio，C.，Ndo，C.，Weill，M.，Simard，F.，and I.V.Sharakhov。 2011. 改进用于研究非洲疟疾载体的群体遗传学工具箱 Anopheles nili ：microsatellite mapping to chromosomes 。寄生虫和向量 4：202.
Sharakhova，M.V.，Xia，A.，Tu，Z.，Shouche，Y.S.，Unger，M.F。和Sharakhov，I.V。（2010）。亚洲疟蚊的物理图，按蚊。 a> Am J Trop Med Hyg 83（5）：1023-1027。
Sharakhova，M.V.，George，P.，Brusentsova，I.V.，Leman，S.C.，Bailey，J.A.，Smith，C.D。和Sharakhov，I.V。（2010）。冈比亚按蚊异黄酮染色体的基因组图谱和表征。 BMC Genomics 11：459.
Sharakhova，M.V.，Antonio-Nkondjio，C.，Xia，A.，Ndo，C.，Awono-Ambene，P.，Simard，F.and Sharakhov，I.V。按蚊尼群岛的细胞遗传图谱：群体遗传学和比较物理图谱应用。 Infect Genet Evol 11（4）：746-754。
Xia，A.，Sharakhova，M.V.，Leman，S.C.，Tu，Z.，Bailey，J.A.，Smith，C.D。和Sharakhov，I.V。（2010）。疟疾蚊子染色体的基因组景观和进化可塑性。<1>/em> 5（5）：e10592