材料和试剂

化学品：没食子酸的合成酯（Ximenes等人，2010）
细菌菌株：野生型柑橘黄单胞菌亚种citri 菌株306（Schaad等人，2005）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：K4000）
Luria-Bertani肉汤（LB）培养基
刃天青钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：R7017）

设备

96孔板，聚苯乙烯，具有透明平底孔（Greiner Bio-one，目录号：655101）
SPECTRAfluor Plus（Tecan）显微荧光光度计
多通道移液器（Eppendorf）

程序

制备溶于10％DMSO（稀释于无菌水中）的化学品储存溶液（干粉样品）
在第1列和第12列中加入100μl水，以避免蒸发（表1）
使用2倍方案（每孔的终体积为100μl）将储备溶液在LB培养基中直接稀释在96孔板中; 在系列稀释后，最浓缩的样品应该含有最多1％的DMSO
细胞在30℃下在LB培养基中在旋转（200rpm）下生长直到OD 600 = 0.6（对数期）。
加入10μl细菌接种物（标准化为10 CFU /孔）
1. 阴性对照：溶于LB中的1％DMSO
2. 阳性对照：卡那霉素15.6μg/ml
  表1. REMA 96孔测定板设置示例
将测试板在30℃孵育6小时。
加入15μl的0.01％（w/v）刃天青溶液，并在30℃孵育2小时。
使用荧光扫描在530nm（激发）和590nm（发射）测量荧光
抑制百分比定义为：
[（平均FU阴性对照） - （平均FU试验）] /（平均FU阴性对照）×100
FU：荧光单位

图1.生长抑制计算示例

注意：应进行三个独立实验，并且数据用于构建化学浓度对细胞生长抑制的图，以确定MIC *（图1）。
最小抑制浓度（MIC）定义为能够抑制90％生物生长的抗生素的最低浓度。

致谢

这项工作得到FAPESP研究资助2004/09173-6,2010/05099-7和2011/07458-7的支持。该协议改编自Palomino等人以前的工作。（2002）。

参考文献

Palomino，J.C.，Martin，A.，Camacho，M.，Guerra，H.，Swings，J.and Portaels，F。（2002）。 Resazurin微量滴定板测定板：用于检测结核分枝杆菌中的耐药性的简单且便宜的方法。 Antimicrob Agents Chemother 46（8）：2720-2722。
Schaad，N.W.，Postnikova，E.，Lacy，G.H.，Sechler，A.，Agarkova，I.，Stromberg，P.E.，Stromberg，V.K.and Vidaver，A.K。（2005）。野油菜黄单胞菌属citri（ex Hasse 1915）Dye 1978形式A，B/C/D和E作为X.smithii subsp。 citri（ex Hasse）sp。 nov。 nom。 rev。梳。 nov。，X.fuscans subsp。 aurantifolii（ex Gabriel 1989）sp。 nov。 nom。 rev。梳。苜蓿， citrumelo（ex Riker and Jones）Gabriel et al。，1989 sp。 nov。 nom。 rev。梳。 nov。野油菜（Avitestris pv malvacearum）（ex smith 1901）Dye 1978 as X.smithii subsp。史密斯梳。 nov。 nom。 nov。野油菜苜蓿（ex Riker and Jones，1935）dye 1978 as X. alfalfae subsp。苜蓿（ex Riker et al。，1935） nov。 nom。 rev。和"var.fuscans"的X.campestris pv。 Phaseoli（ex Smith，1987）Dye 1978 as X.fuscans subsp。弗洛斯坎斯nov。 Syst Appl Microbiol 28（6）：494-518。
Silva，I.C.，Regasini，L.O.，Petronio，M.S.，Silva，D.H.，Bolzani，V.S.，Belasque，J.，Jr.，Sacramento，L.V.and Ferreira，H。（2013）。没食子酸烷基酯对抗黄单胞菌的抗菌活性 195（1）：85-94。
Ximenes，V.F.，Lopes，M.G.，Petronio，M.S.，Regasini，L.O.，Silva，D.H.and da Fonseca，L.M。（2010）。没食子酸及其酯对2,2'-偶氮二（2-脒基丙烷）盐酸盐的抑制作用（AAPH）诱导的溶血和红细胞中细胞内谷胱甘肽的耗尽。 J Agric Food Chem 58（9）：5355-5362。