材料和试剂

淋巴细胞-M（Cedarlane，目录号：CL5035）
RPMI 1640（Hyclone，目录号：SH300027.01）
Chromium-51（PerkinElmer，目录号：NEZ030001MC）
聚（I：C）（Sigma-Aldrich，目录号：P1530）
小鼠脾细胞来源：C57Bl/6小鼠（Charles Rivers，菌株代码：027）
NK敏感性靶细胞系：YAC-1，ATCC，TIB 160
1×无菌PBS（Hyclone，目录号：21-031-CV）
运行缓冲液（Miltenyi Biotech，目录号：130-091-221）
洗涤缓冲液（Miltenyi Biotech，目录号：130-092-987）
AutoMACS pro柱（Miltenyi Biotech，目录号：130-021-101）
AutoMACS缓冲区（请参阅配方）
完成RPMI（参见配方）
NK细胞培养基（参见配方）

设备

50ml管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352098）
15ml管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352096）
96 V孔板（Corning，Costar ，目录号：3894）
AutomacsPro Separator（Miltenyi biotech，型号：130-092-545）
γ计数器（PerkinElmer，型号：2470）
培养箱（5％CO 2，37℃）（Sanyo）
离心机（未指定制动器参数时，使用最大加速度和减速度）（Thermo Fisher Scientific，型号：ST40R）
解剖器械（小钳子，剪刀）
细胞过滤器70μm（Thermo Fisher Scientific，目录号：22363548）
DX5（CD49b）微珠（Miltenyi Biotech，目录号：130-052-501）

程序

体内刺激NK细胞
1. NK细胞需要在体内被刺激以便能够杀死。 Poly（I：C）（TLR3激动剂）注射是激活NK细胞杀伤能力的金标准方法
2. 3 C57Bl/6小鼠（6-8周龄，每只重约20g）通常足以获得足够的NK细胞。然而，对于可能导致淋巴细胞减少或淋巴细胞迁移到周围的任何体内治疗（即病毒感染），可能需要4-5只小鼠。
3. 在安乐死小鼠之前18小时腹膜内（ip）注射用1x PBS（15μl储备液+185μl1×PBS）稀释的150μgPoly（I：C）（储存在-20℃，储备液为10mg/ml）（例如注入如果您计划在第二天上午8:00安乐死小鼠，则在下午2:00。）
4. 准备解剖器械收获脾脏
收获脾细胞
1. 在开始测定前1小时，从4℃除去淋巴细胞。淋巴细胞需要在室温下使用，避免光照（在生物安全柜下关闭灯泡处理）。
2. 为每个脾准备一个50ml管和两个15ml管。在每个打开的50ml管上放置70微米的细胞过滤器。用1ml冷的1×PBS对每个过滤器进行预处理。加入5ml的淋巴细胞到每个15毫升管（保护管从光）。
  注意：1只脾脏需要两根15ml的管，每根管含有5ml的淋巴细胞。
3. 安乐死小鼠颈椎脱位，取出脾脏，并置于70μM滤网上
4. 粉碎1脾细胞过滤器超过50ml管，用10ml的1x PBS冲洗两次（我经常冲洗过滤器的下面，如果可见红色脾脏块）。如果需要，使用相同的过滤器再次用10ml 1×PBS进行过滤。旋转管含有脾细胞，500×g/g，5分钟，4℃
5. 弃去上清液并将脾细胞沉淀重悬于10ml 1x PBS中。小心地将5mL重悬浮的脾细胞层置于淋巴层上（5ml第一个15ml管，然后剩余5ml上的第二个15ml管））。旋转1,500分钟，室温，15分钟，加速度为1，减速度为2（最小速度）。
6. 小心吸取淋巴细胞层（底部淋巴细胞和顶部PBS之间的模糊界面层），并转移到新的50ml管中。因为步骤7和8中的洗涤程序，可以接受少量的淋巴细胞和PBS层。您可以在这里组合小鼠治疗（所有相同的治疗方法）。
7. 用1x PBS填充50ml管（首先洗涤以除去过量的淋巴细胞）。向下旋转500 x g ，5分钟4°C
8. 弃去上清液。重悬在10ml AutoMACS缓冲液中的沉淀。如步骤B-7中那样旋转。在旋转期间，收获目标细胞。弃去上清液。
NK细胞分选（用DX5微珠）
1. 重悬脾细胞沉淀在每个脾脏300微升AutoMACS缓冲液（我们通常每管3个脾）。
2. 每个脾脏添加100微升DX5微珠（制造商建议100微升珠体积为1×10 8个细胞或更少），并充分混合。在4℃孵育15分钟。孵育期间，用铬开始靶细胞标记。
3. 加入10毫升AutoMACS缓冲液停止DX5微珠孵化。旋转，如步骤B-7
4. 弃去上清液。在500μlAutoMACS缓冲液/脾（例如对于3个池脾脏1.5ml）中重悬沉淀物。
5. 继续排序。在最后一次旋转期间打开AutoMACS Pro排序器，并在开始之前冲洗。
6. 放置管架（A行中的输入，B行中的负部分，C行中的正部分）。用于分拣的管的尺寸取决于所使用的AutoMACS机架。通常为3支架的标准50 ml管，5支架的15 ml管和5支6支架的流式细胞仪管。
  注意："Input"=包含要排序的单元格的管; "负分数"=含有DX5-非NK细胞的分选后的洗脱液; "阳性分数"=含有DX5 ⁺ NK细胞的分选后的洗脱液。
7. 选择程序： Possel ，在每个试管之间快速冲洗（qrinse），并在最后一个试管之后冲洗。开始排序。每次排序需要大约5-7分钟，中间有2分钟的时间
8. 分选后，计数阳性部分管中的细胞数（2ml总体积）并测定细胞浓度。如步骤B-7中那样旋转。在旋转过程中，准备96 V孔板（添加100微升NK细胞培养基到所有需要它的孔：3个最小释放孔，所有孔含有25，12和6 E：T比率）。
9. 在NK细胞培养基中以1.5×10 6个细胞/ml的浓度重悬浮分选的NK细胞。
10. 平板NK效应细胞在100微升的顶部两个比例（50：1和25：1），然后稀释2倍下降到12：1和6：1的E：T比率）。方案：每个50：1 E：T孔包含1.5×10 5个NK细胞;每个25：1E：T孔含有7.5×10 4个NK细胞;每个12：1E：T孔含有3.75×10 4个NK细胞;每个6：1E：T孔含有1.875×10 4个NK细胞。
  注意：所有处理和对照在一式三份的孔中接种在100μl中。
11. 用来自在100μl中的30,000个细胞/ml（3,000个细胞/孔）的溶液覆盖具有靶细胞（如步骤IV中制备的）的效应细胞。
12. 向最大释放孔中加入100μl10×SDS
13. 在37℃，5％CO 2中孵育4小时。在500×g和4℃下旋转板，将100μl上清液转移到试管中用于CPM计数。继续先前为⁵¹ Cr。校准的伽马计数器。
14. ％释放测量。
  （最小释放的实验释放平均值）/（最小释放的平均值 - 最大释放的平均值）×100
15. 计算每口井的％。
靶细胞标记
1. 在添加DX5微珠之前的最后一次旋转期间收获YAC-1靶细胞。
  注意：YAC-1靶细胞在cRPMI中生长并且是非粘附的。在用于杀灭测定之前，应将其传代1.5周。
2. 在用DX5微珠孵育脾细胞15分钟时开始⁵¹ Cr标记。
3. 孵育1小时应该在你电泳你的NK效应细胞
4. 洗涤三次（在cRPMI中两次，在NK细胞培养基中最后洗涤），计数并以30,000细胞/ml浓度重悬细胞。

食谱

AutoMACS缓冲液在500ml
中 PBS
2.5g牛血清白蛋白
2ml 5mM EDTA
在500 ml完成RPMI
500ml RPMI-1640
50 ml热灭活胎牛血清
5ml青霉素 - 链霉素10,000U/ml/ml
NK细胞培养基
500 ml cRPMI
5 ml 1 M HEPES
5ml 100mM丙酮酸钠 5 ml 100x非必需氨基酸
0.5ml 2-巯基乙醇，最终浓度为5×10 -5 M

致谢

该协议改编自以下论文：Patel等人（2010）。这项研究由加拿大癌症协会研究所，安大略省区域生物治疗（ORBiT）计划，私人捐助者（D.H.）渥太华医院基金会（R.A. Auer）和魁北克省魁北克省医院（L.-H. Tai和S. Belanger）。

参考文献

Patel，R.，Belanger，S.，Tai，L.H.，Troke，A.D.and Makrigiannis，A.P。（2010）。 Ly49单倍型差异对NK细胞功能和教育的影响 J Immunol 185（8）：4783-4792。