材料和试剂

水合氯化
速溶胶
将生物素化的葡聚糖胺（BDA）（3,000分子量，10％PBS溶液）（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：D-7135）}
Alexa Fluor 488-缀合的霍乱毒素亚基b（Alexa488-CTb，0.5％的盐水溶液）（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：C-34775）}
蒸馏H 2 O（dH 2 O）
戊巴比妥
叠氮化钠
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
Alexa Flour 594-缀合的链霉亲和素（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：S-11227）}
正常驴血清（10％PBS溶液）（Jackson Immuno Research，目录号：017-000-121）
免疫荧光的主要抗体
注意：我们几乎使用自制抗体（Kudo et al。，2012）。
二抗
注意：我们使用来自Invitrogen和/或Jackson Immuno Research的产品，其主机是驴。
乙酸酐
三乙醇胺 - HCl
Formadime
三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS）
Ficoll
聚乙烯吡咯烷酮
牛血清白蛋白（BSA）
tRNA
乙二胺四乙酸（EDTA）
N-月桂酰肌氨酸钠盐（NLS）
硫酸葡聚糖
cRNA探针（Kudo等人，2012; Yamasaki等人，2010）
柠檬酸钠
洛洛酰胺
DIG封闭试剂（Roche Applied Science，目录号：11096176001）
正常绵羊血清（Chemicon，目录号：S22-100ML）
马来酸
酪胺信号放大（TSA）阻断试剂（PerkinElmer Life and Analytical Science，目录号：FP1020）
过氧化物酶缀合的抗DIG抗体（在DIG封闭缓冲液中1:1000）（Roche Diagnostics，目录号：11207733910）
花青3（Cy3）扩增试剂（PerkinElmer Life and Analytical Science，目录号：FP1170）
1x Plus扩增稀释剂（PerkinElmer Life and Analytical Science，目录号：FP1135）
H ₂ 2
用于检测Alexa488-CTb（在兔中生长）（1：1,000稀释）（Invitrogen，目录号：A-11094）的抗Alexa Fluor 488抗体
TOTO-3碘化物（642/660）（PBS中1:50）（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：T3604）}
第一抗体溶液（PBS-T中1μg/ml）
荧光团连接的二抗溶液（PBS-T中1:200）
地高辛（DIG）标记的cRNA探针
二甲基亚砜（DMSO）
封闭试剂（Roche Applied Science，目录号：11096176001）
盐水（见配方）
3.5％水合氯醛（见配方）
0.1 M PB（参见配方）
5 N NaOH（见配方）
4％多聚甲醛（PFA）（参见配方）
20％Tween-20（见配方）
含有0.1％Tween-20（PBS-T）的PBS（参见Recipes）
0.25％无水乙酸的0.1M三乙醇胺-HCl（pH8.0）（参见配方）
1 M Tris-HCl（pH 7.4或8.0）（参见配方）
5 M NaCl（见配方）
0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）（见配方）
杂交缓冲液（参见配方）
标准盐水柠檬酸盐（SSC）（见配方）
NaCl-Tris-EDTA（NTE）缓冲液（参见配方）
Tris-NaCl-Tween（TNT）缓冲液（见配方）
20mM碘酰胺的NTE缓冲液（参见配方）
DIG封锁解决方案（参见配方）
0.5％TSA封闭缓冲液（见配方）
Cy3-TSA放大溶液（参见配方）

设备

剪刀
手术刀
注意：我们使用一套不锈钢手柄（羽毛，3号）和不锈钢备用刀片（羽毛，14号）。
注射器
注射针
立体定位仪（Narishige，型号：SR-5M）
手术棉
气动泵（气动Picopump）（世界精密仪器，型号：PV800）
Puller（Narishige，型号：PC-10）
玻璃移液管（Narishige，型号：G-1.2）
蠕动泵（ATTO公司，型号：SJ-1211H）
软木板
微型切片机（Leica Microsystems，型号：VT1000S）
剃刀刀片
10ml管
共聚焦激光扫描显微镜（Olympus，型号：FV1000）
杂交炉（Bellco，型号：7930-00110）
水浴
荧光显微镜
注意：通过荧光镜单元（Olympus，型号：U-MWIBA3，U-MWIG3）观察Alexa Fluor 488和Cy3或Alexa Fluor 594的荧光信号。
吸气器

软件

共聚焦软件（Olympus，FV10-ASW，ver.1.7）

程序

注射顺行或逆行示踪剂
1. 准备示踪剂溶液和所有需要的设备（剪刀，手术刀，注射器针等）。
  注意：BDA和Alexa488-CTb分别用作顺行或逆行示踪剂。在使用之前先旋转下来的示踪剂解决方案。
2. 麻醉动物与3.5％水合氯醛（350毫克/公斤体重，i.p.）
3. 检查动物被正确的反射失去麻醉和缺乏对爪子的反应。
4. 将麻醉的动物放在立体定位仪上，锁定鼻子和耳朵注意：首先，将辅助耳杆插入鼠标耳道并将其固定，但要小心不要将其过深插入以伤害内耳。接下来，对准鼻夹的垂直高度，并将鼠标齿挂在它上面，然后按住鼻子。检查鼠标头是否不摇晃，以完成固定。
5. 剃去头发，沿着罗斯特 - 尾部轴切开头皮。
6. 使用注射器针头夹入切开的头皮，将其弯成钩子并移除层板注意：要移除椎板，用剪刀剪刀，并用手术棉布擦拭颅骨表面。
7. 使用手术刀切开颅骨，并在示踪剂注射的位置形成一个方形孔
8. 使用拉片准备玻璃吸管。
9. 通过毛细管现象向玻璃吸管中加入约1μl示踪剂溶液，并将其连接到与气动泵连接的管子。
  注意：如果移液管的尖端太细，无法通过毛细现象绘制示踪剂溶液，请轻轻卡住尖端。此外，太细的吸头常常阻碍顺利注射，因为微小的伴随物被吸入移液管。
10. 将玻璃吸管的尖端放置在前囟上，然后立体定位地将移液管插入目标区域。
  注意：为了注射空间，将移液管插入0.1mm深，然后转回目标区域。
11. 通过空气压力以10psi注入示踪剂溶液，间隔5秒，持续1分钟
12. 让移液器插入15分钟，然后小心地拉出。
13. 将取出的颅骨置于方孔上，缝上头皮。
  注意：速溶胶适用于关闭切口部位，以代替手术缝合线。
14. 释放并将动物放回笼子。
15. 保持动物数天，直到固定。
  注意：根据投影距离确定生存期。
  在我们的实验中（在纹状体末端的床核（BST）和腹侧被盖区（VTA）之间），将BDA注射的和Alexa488-CTb注射的动物分别孵育至少4天和2天 Kudo et al。，2012）。
灌注和切片准备
1. 将含有4％PFA固定液（每只小鼠100ml）的烧杯置于冰浴中。将蠕动泵置于蠕动泵上，将硅胶管的一端放入固定烧杯中，另一端安装25G注射器针。
2. 准备所需的所有设备（剪刀，镊子，注射器针头刺穿手/脚等）。
3. 运行蠕动泵，并用固定溶液填充管和注射器针
4. 用过量的戊巴比妥（100mg/kg体重，i.p。）深度麻醉动物。
5. 在确认动物睡着后，用注射器针刺入动物的手和脚在软木板上。
6. 通过水平切割腹部皮肤和肌肉打开腹腔。然后沿着中线切开胸部皮肤，直到下巴，并从胸壁分离皮肤
7. 切开隔膜打开胸腔，然后切开胸壁的两侧以暴露心脏。重要的是不要伤害沿胸骨垂直延伸的胸内动脉。
8. 用锋利的剪刀或注射器针头的坑戳击右耳廓的壁，用连接到固定烧杯的注射器针刺入左心室。
9. 开始心脏灌注10分钟，以便3个固定体积的体重在10分钟内运行
10. 消除固定的大脑和后固定它2小时。使用剃刀刀片，将大脑分成两个块，一个包含示踪剂注射部位，另一个包含感兴趣的神经区域。
  注意：在我们的实验中，我们通过下丘脑和乳头体之间的冠状切割将大脑分为两部分，分别为BST和VTA（Kudo等人，2012）。
11. 使用微量切片机制备固定脑（厚度为50μm）的切片，其缓冲液用0.1M PB填充。
  注意：特别是在自由浮动原位杂交实验中，固定的脑块和切片应保存在PB中。当PBS用作缓冲液时，mRNA信号的检测灵敏度趋于降低。
12. 收集24孔板中的切片并存储在含有0.1％叠氮化钠的0.1M PB中
顺行跟踪结合荧光免疫组化
注意：该方法用于确定轴突末端的神经化学性质，其从顺行示踪剂注射区域预测。囊泡谷氨酸转运蛋白（VGluTs）和囊泡抑制转运蛋白（VIAAT）分别经常用作兴奋性（谷氨酸能）和抑制性（GABA能和甘氨酸能）终端标记（Kudo等人，2012;本手册中的图1）。通过使用其他神经化学标记物与顺行跟踪组合，还可以确定该投影是胆碱能的，血清素能的，多巴胺能的，肾上腺素能的，组织素能的还是肽能的。
1. 从BDA注射的大脑准备切片。
2. 选择含有注射区域的切片并通过在Alexa Flour 594缀合的链霉亲和素（在PBS中1:500）孵育10分钟来显现BDA信号。使用荧光显微镜照片BDA的注射部位。
3. 在含有含有0.1％Tween-20（PBS-T）的PBS的10ml管中浸没1〜3个神经化学测试切片10分钟。
4. 用10％正常驴血清在PBS中封闭20分钟注意：阻断和抗体溶液每管约0.5ml，每次洗涤的洗涤溶液为〜10ml。通过使用吸气器，溶液交换是高效的，但应小心不要吸入或干燥部分。
5. 在一抗溶液（1μg/ml，在PBS-T中）孵育过夜
6. 用PBS-T洗涤5分钟三次。
7. 在荧光团连接的二抗溶液（PBS-T中1:200）孵育2小时以进行神经化学标记物检测。
8. 用PBS-T洗涤5分钟三次。
9. 短暂用PBS清洗。
10. 孵育在Alexa面粉594共轭链霉亲和素（PBS中1:500）10分钟进行BSA检测。
11. 用PBS洗涤5分钟三次。
12. 在玻片上安装切片，制成盖玻片，并使用荧光显微镜观察注意：使用共聚焦激光扫描显微镜捕获图像，以12位分辨率数字化为640×640像素（像素尺寸，0.1μm）的阵列。为了研究BDA标记的轴突末端的神经化学特性，从每个切片拍摄描绘区域的图像（x60放大率，x3放大）。为了分析，我们计数终点标记阳性boutons的中心点与BDA标记的匹配。通常观察到仅用BDA标记的bouton样结构。如果它们没有标记其他终端标记，它们不应该用于计数（图1）。
  
  图1.组合的顺行示踪剂标记和免疫荧光。 BDA注射到纹状体末端（BST）的床核中，并顺行转运到腹侧被盖区（VTA）。在含有VTA的切片中，进行2型囊泡谷氨酸转运蛋白（VGluT2;绿色）和囊泡抑制性氨基酸转运蛋白（VIAAT;蓝色）的BDA染色（红色）和免疫荧光。图像用于计数（x60放大率，x3缩放）。 VGluT2-阳性BDA轴突末端（箭头）和VIAAT-阳性BDA轴突末端（箭头）分别被鉴定为来自BST的谷氨酸能和GABA能神经传入。比例尺：10μm
逆行跟踪与自由浮动荧光原位杂交（FISH）结合
注意：这种方法用于确定神经元的神经化学性质，其将它们的轴突投影到逆行示踪剂注射区域。建议准备切片并在同一天开始FISH孵育，因为检测灵敏度在切片后显着降低。 VGluTs和谷氨酸脱羧酶（GAD）（或VIAAT）mRNA的表达分别用于确定兴奋性和抑制性神经元的神经化学性质（Kudo等，2012;本文中的图2）。
1. 从注射Alexa488-CTb的大脑准备切片。
2. 使用荧光显微镜检查Alexa488-CTb的注射部位。
3. 将单个部分浸没在含有PB的10ml管中。
  注意：建议一个管使用一个管，因为每个管多于两个管会降低反应灵敏度。对于自由漂浮的FISH，杂交，抗体反应，过氧化物酶失活，荧光检测和复染的溶液为每管约0.5ml，并且每次洗涤的洗涤溶液为〜10ml。通过使用吸气器，溶液交换是高效的，但应小心不要吸入或干燥部分。
4. 用0.25％无水乙酸盐在0.1M三乙醇胺-HCl（pH 8.0）中乙酰化切片10分钟注意：在使用时准备解决方案。
5. 在杂交缓冲液中预杂交1小时
6. 在稀释度为1:1000的杂交缓冲液中补充地高辛（DIG）标记的cRNA探针，在63.5℃下进行12小时。
  注意：DIG标记的cRNA探针的制备在之前的我们的报告中描述（Kudo等人，2012; Yamasaki等人，2010）。杂交在杂交炉中进行。用石蜡膜覆盖管尖，以避免干燥。
7. 在61℃下，用5×SSC洗涤30分钟，用含有50％甲酰胺（甲酰胺1）的4×SSC洗涤40分钟，用含有50％甲酰胺（甲酰胺2）的2×SSC洗涤40分钟，并用0.1×SSC洗涤15分钟。 br /> 注意：溶液在61°C的热水浴中预热，洗涤步骤在热水浴中进行。
8. 在室温（RT）下，在0.1x SSC中孵育15分钟，在NTE缓冲液中20分钟，20mM碘酰胺在NTE缓冲液中孵育20分钟，NTE缓冲液孵育10分钟，并且TNT缓冲液孵育10分钟。注意：所有后续步骤均在RT执行。
9. 用DIG封闭缓冲液封闭切片30分钟，用0.5％TSA封闭缓冲液封闭切片30分钟
10. 在DIG封闭缓冲液（1:1000）中在过氧化物酶缀合的抗DIG抗体中孵育2小时。
11. 用TNT缓冲液洗涤15分钟两次。
12. 使用Cy3-TSA plus扩增试剂盒系统（参见配方20）在阴影中进行10分钟检测过氧化物酶的信号。
13. 用TNT缓冲液洗涤5分钟三次。
14. 对于残留的过氧化物酶活性的失活，在TNT缓冲液中的3％H 2 O 2中孵育30分钟。
  注意：这个失活步骤对于增强信号的对比度很重要。如果跳过此步骤，背景信号将保持强，以及真阳性信号。
15. 用TNT缓冲液洗涤5分钟三次。
16. 使用荧光显微镜检查目标mRNA的荧光信号注意：因为Alexa488-CTb的荧光变弱并且在杂交和杂交后洗涤后容易灭活，所以应当使用抗Alexa Fluor 488抗体通过免疫荧光检测示踪剂，如过程III所示。
17. 对Alexa488-CTb进行免疫荧光后，用TOTO-3（PBS中1:50）复染20分钟。
18. 在玻片上安装切片并使用荧光显微镜观察注意：为了研究逆行追踪神经元的神经化学组成，收集平铺图像以覆盖整个示踪区域（x20放大倍数，x1.3缩放），并计数具有核的阳性细胞的数量（显示TOTO-3信号）（图2）。
  
  图2.组合的逆行示踪物标记和荧光原位杂交。将Alexa488-CTb注射到VTA中，并逆转运输到BST。在含有BST的切片中，进行Alexa Fluor 488（绿色）的免疫荧光，GAD mRNA（红色）的荧光原位杂交和TOTO-3（蓝色）的复染色。顶部图像是用于计数的平铺图像的一部分（x20放大率，x1.3缩放），底部图像是较高放大率（x60放大率，x1.0缩放）。共标记GAD mRNA和CTb（箭头）的神经元被鉴定为VTA-突出的GABA能神经元。比例尺：顶部，100μm;底部，30μm

食谱

盐水
NaCl 9g/L dH 2 O 6/g
3.5％水合氯化
水合氯醛1.75g/50ml dH 2 O
0.1 M PB
制备1升0.1M PB
将2.95g的NaH 2 PO 4·4·2H 2·2H 2 O和29g的Na 2 SO 4·2H 2 O混合， /sub>HPO_{4_{^.12HO
将dH 2 O加至1L并搅拌〜30分钟
存储在4°C}}
5 N NaOH
NaOH 40g/200ml dH 2 O
4％PFA
使1L的PFA
制备500ml的8％PFA（溶液（a））
加热500ml dH 2 O至80℃（不煮沸）
加入40g PFA粉末，搅拌〜10分钟
加入250μl5N NaOH，并保持搅拌直到溶液变得清澈
接下来，在另一个烧杯中制备500ml的0.2M PB（溶液（b））将2.95g的NaH 2 PO 4·4·2H 2·2H 2 O和29g的Na 2 SO 4·2H 2 O混合， /sub>HPO_{4_{^.12HO
将dH 2 O加入到500ml中并搅拌〜30分钟
混合溶液（a）和溶液（b），搅拌〜5分钟
过滤并储存在4°C}}
PBS
制备1升10x PBS储备液
将87g的NaCl，3.1g的NaH 2 PO 4·4·2H 2·2H 2 O和28.7g的Na ₂ HPO ₄ ^。 12H ₂ O
将dH 2 O加入到1L中并搅拌〜2h
在RT存储
使用dH 2 O稀释该10倍储备溶液1/10
20％Tween-20
通过搅拌，混合20ml吐温-20和80ml ddH 2 O 存储在4°C
含有0.1％Tween-20（PBS-T）的PBS 加入2.5ml的20％吐温-20与500ml的PBS
在RT存储
0.25％无水乙酸在0.1M三乙醇胺-HCl（pH8.0）中的溶液制备100ml乙酰化溶液
通过搅拌
将三乙醇胺-HCl与100ml dH 2 O混合加入950微升5 N NaOH，确保pH为8.0
加入250微升乙酸酐（*使用前添加），并搅拌〜3分钟
1 M Tris-HCl（pH 7.4或8.0）
制备1 L Tris-HCl缓冲液
将121.1g的Tris碱（三（羟甲基）氨基甲烷）与800ml的dH 2 O混合。用盐酸将pH调至7.4或8.0 将dH <2> O添加到1 L
高压灭菌，然后在室温贮存
5 M NaCl
制备1L的5M NaCl
通过搅拌混合292.2g NaCl和800ml dH 2 O 将dH 2 O加至1L并搅拌直至它们完全溶解
高压灭菌，然后在室温贮存
0.5M乙二胺四乙酸（EDTA）制备500ml 0.5M EDTA
将93.1g EDTA与400ml dH 2 O混合用5N NaOH将pH调至8.0 将dH <2> O添加到500ml
高压灭菌，然后在室温贮存

杂交缓冲区
制备500ml杂交缓冲液
高压灭菌两个500毫升烧杯; 一个用250ml的dH 2 O 2填充，另一个是空的
在烧杯冷却后，将80ml高压灭菌的dH 2 O和250ml甲酰胺倒入空烧杯中
添加下表中描述的试剂

试剂数量
1 M Tris-HCl（pH 8.0）	16.5毫升
tRNA	100 mg
100x Denhardt *	5 ml
5M NaCl	60 ml
0.5 M EDTA	1 ml
NLS	0.5克
硫酸葡聚糖	50克

* 100x Denhardt's

试剂	数量（50 ml）	最终浓度（100x）
Ficoll	1克	2％（w/v）
聚乙烯吡咯烷酮	1克	2％（w/v）
BSA	1克	2％（w/v）
dH 2 2 O	到50 ml

将高压灭菌的dH 2 O加至500ml，然后振荡溶解〜24小时。
过滤，然后在-30℃下储存

标准盐水柠檬酸盐（SSC）
制备1 L 20x SSC储备液
将175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠混合加入dH2O至1L并搅拌〜2小时
自动保存，然后在RT存储
按照下表所述稀释该20x储备溶液

	5x SSC （1升）	0.1x SSC （1升）	甲酰胺1 （150ml）	甲酰胺2 （150ml）
20x SSC	250 ml	5 ml	30 ml	15 ml
20％Tween-20	25μl	25μl	7.5μl	7.5μl
甲酰胺	-	-	75 ml	75 ml
dH 2 2 O	到1 L	到1 L	到150ml	到150ml

在RT存储

NaCl-Tris-EDTA（NTE）缓冲液要生成1升NTE缓冲区
混合100ml的5M NaCl，10ml的1M Tris-HCl（pH8.0），10ml的0.5M EDTA和25μl的20％Tween-20
将dH <2> >添加到1 L并在RT保存
Tris-NaCl-Tween（TNT）缓冲液
制作1升TNT缓冲液
将30ml 5M NaCl，100ml 1M Tris-HCl（pH7.4）和25μl20％Tween-20混合，将dH <2> >添加到1 L并在RT保存
20mM碘酰胺的NTE缓冲液中碘乙酰胺0.37g/100ml NTE缓冲液
DIG封闭溶液
正常绵羊血清：10％封闭试剂*：TNT缓冲液= 1:1:8
* 10％封闭试剂（10ml）
1. 制备马来酸缓冲液
  制备500ml马来酸缓冲液
  将58.1g马来酸和43.9g NaCl与400ml dH 2 O混合。用5N NaOH将pH调节至7.5
2. 用马来酸缓冲液溶解1g阻断试剂至10ml，振荡和加热
  高压灭菌，然后储存在-80°C
0.5％TSA封闭溶液
向100毫升TNT缓冲液中加入0.5克封闭试剂为了溶解封闭试剂，在搅拌下加热至60℃1小时
储存于-20°C
Cy3-TSA扩增溶液
将60μlDMSO加入Cy3扩增试剂（Cy3溶液;在4℃保存）将此Cy3溶液稀释在1x Plus扩增稀释液（1:200）中。

致谢

该协议改编自Kudo等人（2012）。

参考文献

Kudo，T.，Uchigashima，M.，Miyazaki，T.，Konno，K.，Yamasaki，M.，Yanagawa，Y.，Minami，M.and Watanabe，M。（2012）。三种类型的神经化学投影从成年小鼠的纹状终端的床核到腹侧被盖区。 J Neurosci 32（50）：18035-18046。
Yamasaki，M.，Matsui，M.and Watanabe，M.（2010）。优先本地化在树突状细胞轴上的毒蕈碱M1受体和皮质锥体细胞的脊柱及其传播的解剖学证据。 30（12）：4408-4418。