材料和试剂

H1 HeLa细胞
脊髓灰质炎病毒
蔗糖（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：15503-022）}
不含甲硫氨酸的DMEM（Life Technologies，Gibco ，目录号：21013）
MEM（Life Technologies，Gibco ，目录号：11095-080）
甲硫氨酸（PerkinElmer，目录号：NEG772002MC）
矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M5904）
SDS-PAGE凝胶
Nonidet P-40（NP-40）（Sigma-Aldrich，目录号：N-6507）
苯基甲磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P3075-1G）
40 U核糖核酸酶抑制剂（Promega Corporation，目录号：N2111）
4x Laemelli加载缓冲区
Tris缓冲液（见配方）
裂解缓冲液（见配方）
凝胶固定剂（参见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）
PBS +（请参阅配方）

设备

离心管（Beckman Coulter，目录号：344059）
1.5 ml Eppendorf管
蠕动泵（Bio-Rad Laboratories，型号：731-9001EDU）
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima L-90K）
SW41Ti转子（Beckman Coulter，型号：331362）
馏分收集系统（Beckman Coulter，目录号：270-331580）
梯度仪（Biocomp Gradient Master，型号：107）
液体闪烁计数器（Beckman Coulter，型号：LS6000IC）
凝胶干燥器（Bio-Rad Laboratories，型号：583）

程序

病毒和亚病毒颗粒的分离
1. 感染贴壁细胞在10厘米的菜，在MOI为50.该病毒应该稀释在500微升的PBS +。孵育细胞与病毒单独在37℃下30分钟，然后加入8毫升MEM。在感染时细胞应该约80％汇合
2. 通过每毫升不含甲硫氨酸的DMEM加入100μCi[sup] 3S]甲硫氨酸制备[supra] S [甲硫氨酸-DMEM]。
3. 在感染后3小时从细胞中除去培养基，向细胞中加入3ml不含甲硫氨酸的DMEM，然后除去。重复该过程两次另外的洗涤，然后将6ml步骤A-2中制备的[35 S]甲硫氨酸DMEM加入细胞。
4. 在所需的收集时间点，从细胞中除去[sup] 3S]甲硫氨酸DMEM。用3ml PBS洗涤细胞3次，并向板中加入1ml裂解缓冲液。通过上下吹吸数次从板中取出细胞。然后将裂解物（细胞和裂解缓冲液）转移到1.5ml试管中
5. 通过在4℃下以4,500×g离心10分钟（在冰上储存裂解物，直到其加入到梯度中），从该裂解物中移除核。
6. 使用Tris缓冲液制备15％（w/v）和30％（w/v）蔗糖溶液
7. 按照梯度制造商的说明，倾倒15-30％蔗糖梯度
8. 应用500μl裂解物到梯度的顶部。在放射性标记的裂解物上加入约200μl矿物油
9. 在超速离心机中以27,500rpm，15℃离心3小时。超速离心机应编程为无制动的慢加速和减速。
10. 将管置于馏分收集系统中。
11. 打开泵，开始在梯度顶部抽空空气。立即刺破试管，使蔗糖流出离心管的底部。
12. 从梯度中收集0.5ml级分到1.5ml管中。应收集整个梯度。级分可以在-20℃储存长达一年。
13. 使用液体闪烁计数器确定级分中的放射性
标记蛋白质在级分中的可视化
1. 混合15微升的每个部分与5微升的4x Laemelli加载缓冲液
2. 将样品加热至95°C
3. 使用12％SDS-丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE分离蛋白质
4. 在凝胶固定剂中在室温下摇动固定凝胶过夜。
5. 使用凝胶干燥器的干凝胶
6. 使用标准放射自显影技术可视化蛋白质。

食谱

Tris缓冲液
10mM Tris（pH7.4） 10mM NaCl 1.5mM MgCl 2·h/v
裂解缓冲液
10ml Tris缓冲液
1％NP-40
1μMPMSF
40 U RNAsin
凝胶固定剂
50％甲醇
10％乙酸的蒸馏水溶液中
PBS（使1 L）
137 mM NaCl 2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
1.8mM KH 2 PO 4 sub/
将试剂溶解在800ml ddH 2 O中，将pH调节至7.5，然后将ddH 2 O加至1L。
为了制备PBS +，加入1mM CaCl 2 2，2H 2 O 2和0.5mM MgCl 2。/sup> 6H 2 O。

致谢

该协议改编自Richards和Jackson（2012）。

参考文献

Richards，A.L.和Jackson，W.T。（2012）。胞内囊泡酸化促进感染性脊髓灰质炎病毒颗粒的成熟。 PLoS Pathog 8（11）：e1003046。