材料和试剂

人外周血
RPMI1640 + L-谷氨酰胺+ HEPES（Life Technologies，目录号：22400-105）
FBS（在56℃下灭活30分钟）（Hyclone定义的FBS，目录号：SH30070.03）
青霉素/链霉素（Life Technologies，目录号：15070-063）
L-谷氨酰胺（200mM）（Life Technologies，目录号：25030-081）
0.4％台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
HBSS（Corning/Cellgro，目录号：MT-21-023-CV）
PBS
25％人血清白蛋白（HSA）（Plasbumin ^{-25）（Talecris Biotherapeutics，NDC编号：13533-684-20）}
重组人IL-2（Peprotech，目录号：200-02）
重组人M-CSF（Peprotech，目录号：300-25）
牛血清白蛋白（BSA）（来自牛血清的白蛋白，冻干粉，≥96％）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153-100G）
C1q（Comptech，Texas，目录号：A099）
用于通用细胞膜标记的PKH26红色荧光细胞接头试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：PKH26GL）
CellStripper离解试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：25-056-CI）
细胞凋亡检测试剂盒（BioVision，目录号：K101-100）
抗人C1q（Quidel，目录号：A201）
FITC缀合的抗小鼠IgG（Jackson Immunoresearch，目录号：115-096-006）
FcR阻断试剂人（Miltenyi，目录号：130-059-901）
FITC缀合的抗人CD11b（Life Technologies，目录号：CD11B01）
FITC小鼠IgG1同种型（Life Technologies，目录号：MG101）
荧光素鬼笔环肽（Life Technologies，目录号：F432）
Stericup（Thermo Fisher Scientific，目录号：SCGVU11RE）
长寿黄金抗衰减试剂（Life Technologies，目录号：P36930）
氯化铵（无水）
碳酸氢钠
EDTA二钠
NaN ₃
胰蛋白酶
完成媒体（见配方）
吞噬作用缓冲液（参见配方）
ACK缓冲区（参见配方）
FACS缓冲区（请参阅配方）

设备

50毫升锥形管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339653） - 重要的单核细胞粘在其他管
12×75mm聚丙烯圆底无菌管（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-956-1D）
12×75mm聚苯乙烯圆底管（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-961-13）
组织培养板和通风瓶（任何尺寸）
Eppendorf微量离心管
12mm盖玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：GG12），通过在70％乙醇中浸泡2×5分钟灭菌
非组织培养处理的100mm培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：0875712） - 称为培养皿
组织培养罩
伽玛辐照器
5％CO 2，37℃加湿培养箱
离心机用于50ml锥形管和5ml底圆管
离心机带有用于板的旋转叶片转子（Sorvall，型号：RT7000或等同物）
光学和共聚焦荧光显微镜
血细胞计数器
流式细胞仪
自动移液器（全量程）
提示（全范围音量）
24孔板

程序

淋巴细胞分离，染色和凋亡诱导。
1. 收集来自淘析的前两个50ml的流出物管，其含有淋巴细胞（单核细胞保留在淘析室中）。
2. 以700rpm（100×g）离心淋巴细胞悬液10分钟，RT（室温），以除去大多数血小板。
3. 弃去上清液和池细胞沉淀在10毫升ACK缓冲液（以删除残留的红细胞）。孵育2-5分钟RT
4. 加入20ml完全培养基。
5. 以700rpm（100×g）离心细胞悬浮液10分钟，RT
6. 弃去上清液并将细胞沉淀重悬在20ml HBSS中。使用0.4％台盼蓝溶液，血细胞计数室和光学显微镜计数活细胞数。
7. 以700rpm（100×g）离心细胞悬浮液10分钟，RT
8. 在一个通风的组织培养瓶中，将完整培养基中的淋巴细胞以1百万/ml重悬
9. 加入100U/ml重组人IL-2。
10. 在37℃，5％CO 2孵育7天
11. 离心淋巴细胞悬浮液5分钟1,200rpm（300×g）
12. 弃去上清液并用10ml HBSS洗涤细胞沉淀。使用0.4％台盼蓝溶液，血细胞计数室和光学显微镜计数活细胞数
13. 离心细胞悬液5分钟1,200rpm（300×g）。
14. 弃去上清液并在1ml稀释液C的PKH26红色荧光细胞接头试剂盒中重悬20万个淋巴细胞。
15. 稀释4μlPKH26染料在1 ml稀释剂C（4μM）
16. 混合染料和细胞（PKH26最终2μM），轻轻倒转试管，孵育5分钟RT。
17. 加入2ml FBS。混合好。孵育1分钟RT。
18. 加入16毫升完全培养基。通过反转混合均匀。将细胞悬浮液离心10分钟，1200rpm（300×g ）
19. 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于10ml完全培养基中。将细胞悬浮液离心10分钟，1200rpm（300×g ）
20. 重复步骤19两次，共进行3次洗涤。
21. 使用0.4％台盼蓝溶液，血细胞计数室和光学显微镜计数活细胞数
22. 在T25通气的组织培养瓶中，在不含FBS的RPMI1640培养基中以2百万/ml（在25ml中高达5000万）重悬PKH26标记的淋巴细胞。
23. 通过将淋巴细胞暴露于γ-照射（10Gy）诱导凋亡。
24. 在完全培养基（对于早期凋亡细胞）中，将淋巴细胞在37℃下孵育过夜5％CO 2，以2百万/ml的晚期凋亡细胞的无血清RPMI。
单核细胞的分离和培养
1. 从淘洗室回收单核细胞后，在HBSS中洗涤，计数，并在完全培养基（第0天）中以0.5百万/ml重悬。
2. 加入10毫升每100毫米培养皿。
3. 加入重组人M-CSF至终浓度为25ng/ml
4. 置于37℃，5％CO 2
5. 3-4天后，每板加入5ml新鲜完全培养基（含25ng/ml M-CSF）。
6. 在第6-8天，从培养皿中弃去培养基，用5ml HBSS洗涤贴壁细胞两次。
7. 弃去最后一次HBSS洗涤，并向板中加入5 ml CellStripper，孵育20-30分钟RT
8. 上下移动以分离细胞并转移至含有25ml预热的完全培养基（一个管= 5个板，终体积为50ml）的50ml锥形管中。
9. 离心细胞悬浮液1200rpm（300×g），RT下5分钟
10. 用10ml HBSS洗涤细胞沉淀两次，离心细胞悬液5分钟1,200rpm（300×g）。
11. 使用0.4％台盼蓝溶液，血细胞计数室和光学显微镜计数活细胞数
12. 将人单核细胞来源的巨噬细胞（HMDM）以0.25×10 6/ml在完全培养基中，500细胞/mm 2培养板上。对于免疫细胞化学（ICC），平板细胞在含有12mm盖玻片（0.5ml）的24孔板中。
13. 在37℃，5％CO 2中孵育过夜。
C1q与凋亡淋巴细胞的结合
1. 转移凋亡淋巴细胞到锥形管。使用来自Biovision的凋亡检测试剂盒通过流式细胞术评估细胞凋亡
2. 离心细胞悬浮液5分钟1,200rpm（300×g）
3. 弃去上清液并小心地将淋巴细胞重悬在10ml预热的HBSS中。使用0.4％台盼蓝溶液，血细胞计数室和光学显微镜计数ALL细胞（活的和可渗透的）。
4. 将细胞悬浮液离心5分钟，1200rpm（300×g ）
5. 在无菌的12×75mm圆底管中，将细胞沉淀以5×10 6个细胞/ml悬浮于HBSS/1％HSA中。
6. 根据所需的C1q包被的凋亡细胞的数量，将人纯化的C1q加至终浓度为150μg/ml。轻轻地上下移动或倒转混合。
7. 在37°C孵育1小时，每15分钟轻轻摇动管
8. 每管加入2ml HBSS，并在1200rpm（300×g）下离心细胞悬浮液5分钟。
9. 弃去上清液，每管加入2ml HBSS，并在1,200rpm（300×g）下离心细胞悬浮液5分钟。
10. 在吞噬作用缓冲液中以所需浓度重悬细胞沉淀用于摄取测定。放置2×10 5个凋亡淋巴细胞+/- C1q以评估如下所述的C1q结合效率。
C1q结合效率
1. 在100μlFACS缓冲液中重悬2×10 5个凋亡淋巴细胞+/- C1q。
2. 加入1-2μl鼠抗人C1q，并在冰上孵育30分钟
3. 加入2ml FACS缓冲液，离心细胞悬液5分钟1,200rpm（300×g），4℃。
4. 弃去上清液并将细胞沉淀悬浮于100μlFACS缓冲液中。
5. 加入1微升FITC结合的抗小鼠IgG，并在冰上在黑暗中孵育30分钟
6. 加入2ml FACS缓冲液，在4℃下离心细胞悬浮液5分钟1,200rpm（300×g）。
7. 弃去上清液并在200μlFACS缓冲液中重悬细胞沉淀
8. 通过流式细胞术分析以确定C1q与凋亡淋巴细胞的结合效率。结合C1q的凋亡细胞的百分比应大于50％。
摄取测定
1. 回收来自部分C的人单核细胞衍生的巨噬细胞（HMDM）板。弃去培养基并用HBSS洗涤贴壁细胞两次。
2. 恢复步骤IV-10的凋亡淋巴细胞。在吞噬作用缓冲液中以5:1的比例加入凋亡淋巴细胞+/- C1q（例如5×10 5个凋亡淋巴细胞，1×10 5个HMDM），最终总体积每6孔板孔2ml）。
3. 以700rpm（100×g）将板离心3分钟。
4. 在37℃下孵育1小时。
5. 通过流式细胞术评估吸收：
  1. 弃去培养基，用HBSS洗涤贴壁细胞两次
  2. 加入0.5ml 0.05％胰蛋白酶并在37℃下孵育2分钟。吸取细胞上下和转移到12×75毫米管（显微镜检查所有巨噬细胞已回收）。
  3. 离心细胞5分钟1,200rpm（300×g），室温
  4. 弃去上清液并将细胞沉淀重悬在100 ml FACS缓冲液中
  5. 每1×10 6个细胞加入5μlCD11b-FITC抗体，在冰上在黑暗中孵育45分钟。
  6. 加入2ml FACS缓冲液，在4℃下，以1200rpm（300×g）旋转5分钟。
  7. 离心细胞5分钟1,200rpm（300×g），室温
  8. 弃去上清液并重悬于300μlFACS缓冲液中以进行读数
  9. 通过流式细胞术分析
6. 为了评估ICC的摄取（使用放置在24孔板中的12mm盖玻片）。
  1. 在步骤E-5之后，弃去培养基并用0.5ml HBSS洗涤贴壁细胞两次
  2. 用3.7％甲醛（300μl/孔）固定细胞，RT 10分钟。
    注意：不要使用甲醇或丙酮，因为它可能破坏凋亡淋巴细胞的PKH26膜标记。
  3. 用PBS洗涤细胞两次。
  4. 染色细胞用每孔4U FITC-鬼笔环肽在250μlPBS中稀释20分钟RT。
  5. 用PBS洗涤细胞两次。
  6. 安装盖玻片与一滴延长金抗衰减试剂。
  7. 通过荧光或共聚焦显微镜分析

食谱

填写媒体
RPMI1640 + L-谷氨酰胺+ HEPES（500ml） 50ml（10％）热灭活的FBS 5ml（1％）青霉素/链霉素 5ml（1％）200mM L-谷氨酰胺
吞噬缓冲液
RPMI1640 + L-谷氨酰胺+ HEPES
25 mM HEPES
5mM MgCl 2/
ACK缓冲区
向450ml milliQ水中加入
4.145克氯化铵（无水）
0.5克碳酸氢钠 18.6mg EDTA二钠
将pH调节至7.4
用milliQ水
使最终体积达到500 ml 使用stericup过滤灭菌
FACS缓冲区
500ml HBSS（无酚红）
0.2％NaN 3
0.2％BSA

致谢

如先前所述（Bobak等人，1986），使用Lionetti等人（1980）的技术的修改通过逆流淘析分离人外周血淋巴细胞和单核细胞。。

参考文献

Benoit，ME，Clarke，EV，Morgado，P.，Fraser，DA和Tenner，AJ（2012）。人体吞噬细胞上C1q受体表达的表征：PDBu和fMLP的作用。 Immunol 136（12）：4604-4610。
Lionetti，F.J.，Hunt，S.M.，Valeri，C.R。（1980）。细胞分离方法。纽约：Plenum出版公司。