材料和试剂

设备

程序

注意：根据修改的方案制备小鼠皮质的PSD级分。

在显微镜下在冷PBS中取出皮质。如果不立即使用，可储存在-80°C。将脑在Dounce微型匀浆器中匀浆50次。解剖1半皮质（或2 Hipp），加4毫升缓冲液均匀化为看起来乳白色，没有明显的组织碎片。
如果以下没有指出，所有实验在4℃下进行。
匀浆在470×g离心2分钟。
将所得上清液（S1级分）以10,000×g离心10分钟，以获得富含线粒体和突触小体的沉淀（P2）和含有可溶性蛋白质的上清液（S2级分）。
将P2级分重悬浮于3.75ml 0.32M蔗糖中，然后将其分层到0.8M蔗糖上。在摇摆转子中以9,100×g离心15分钟。
离心后，从0.8M蔗糖层（图1）收集突触体（大多数松散的沉淀），并用等体积的20mM HEPES（pH 7.0），2％Triton X-100和150mM KCl重悬。

图1. PSD级分的蔗糖超速离心。
使用固定角转子将样品在20,800×g离心45分钟，收集所得上清液作为突触前级分。
使用Dounce微型匀浆器将沉淀重悬浮于1％Triton X-100和75mM KCl的溶液中，并再次在20,800×g离心30分钟，得到最终沉淀（PSD级分，其被鉴定通过标记PSD95），其用20mM HEPES洗涤并溶解在1x SDS-PAGE样品缓冲液中

食谱

致谢

这项工作部分得到了美国心脏协会（C.Y）的资助。方法之前简单描述在Tao等人（2013）中。

参考文献

Tao，Y.，Chen，YJ，Shen，C.，Luo，Z.，Bates，CR，Lee，D.，Marchetto，S.，Gao，TM，Borg，JP，Xiong，WC和Mei， 2013）。 Erbin与TARP gamma-2相互作用，用于皮质中间神经元中AMPA受体的表面表达。 Nat Neurosci 16（3）：290-299。