材料和试剂

液氮
BCA试剂（Tiangen Biotech，目录号：PA115-01）
牛血清白蛋白
AZC L-半乳甘露聚糖（Megazyme，目录号：I-AZGMA）
商业黑曲霉内切-β-甘露聚糖酶（Megazyme，目录号：E-BMANN）
100mM苯甲磺酰氟（PMSF）（参见配方）
0.5M乙二胺四乙酸（EDTA）（参见配方）
提取缓冲液（参见配方）
0.1 M乙酸钠缓冲液（pH 5.0）（参见配方）

设备

砂浆和杵
10,000 截止过滤器（EMD Millipore，目录号：UFC801096）
离心机
培养箱振动器
水浴
酶标仪或分光光度计

程序

将样品（约10g产生的木质部或来自一年生杨树的叶）在液氮中研磨成细粉并在1.5体积倍数的提取缓冲液中在4℃下均化1小时（可以检测到强的酶活性在开发木质部）。
匀浆在10,000xg在4℃离心30分钟。
然后使上清液通过10,000μm截止滤器，并脱水， 500μl，然后在4℃下在0.1M乙酸钠缓冲液（pH5.0）中将蛋白质稀释至〜1μg/μl。
使用牛血清白蛋白作为标准通过BCA试剂测量蛋白质提取。
将含有100μl1％AZC L-半乳甘露聚糖（w/v，在0.1M乙酸钠缓冲液中，pH5.0）和20μg提取的蛋白质或加热的无活性蛋白质（100℃10分钟，作为对照）的200μl反应混合物，在40℃下连续振荡孵育2小时
将反应混合物在100℃下煮沸5分钟，并以12,000×g离心5分钟。
测定上清液在590nm处的吸光度（A）。使用加热的无活性蛋白获得的背景值（A sub）从使用活性提取物（A = A 1）获得的值（A sub） - A ₀）。
标准化
1. 在以下条件下测定市售黑曲霉内切-β-甘露聚糖酶（E-BMANN，Megazyme）的系列稀释液的酶活性：将200μl含有100μl1％AZC L-半乳甘露聚糖和E-BMANN在40℃温育2小时。
2. 与E-BMANN活性相关的标准曲线如图1所示。对于0.05〜0.9范围内的吸光度值，可以参考下列公式计算这些值：Y = SX + C其中：
  Y =内切-β-甘露聚糖酶活性（以微单位/测定，即每200μl为）
  S =校准曲线的斜率
  X =在590nm处的反应吸光度（A）
  C =在Y轴上截取
3. 根据制造商的说明，一个活性单位定义为在限定的测定条件（1微单位= 1pmol/min）下每分钟释放1微摩尔甘露糖还原糖当量所需的酶量。
酶活性的计算：样品中内切-β-甘露聚糖酶活性通过参照标准曲线确定，以将吸光度值转化为每个测定的微单位（Y），然后进一步改变为每μg蛋白的微单位（Y/[20 μg蛋白质]，pmol/min/[μg蛋白质]）

图1.商业内切-β-甘露聚糖酶上的内切-β-甘露聚糖酶标准曲线。

食谱

100mM苯基甲磺酰氟（PMSF）10ml 将0.174g PMSF与10ml异丙醇混合以小等分试样储存在-20℃下
0.5M乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）（1L）在800ml dH 2 O中溶解186.1g EDTA-Na 2 H 2 2H 2 O。用NaOH（〜20g NaOH颗粒）将pH调节至8.0 将dH <2> O添加到1 L
在121℃高压灭菌20分钟
在RT存储
提取缓冲液（1 L）
1M乙酸钠缓冲液（pH5.0） 10 mM EDTA
10mM叠氮化钠 3 mM PMSF
将57ml冰醋酸（1.05g/ml）和20ml 0.5M EDTA与800ml dH 2 O混合。
用NaOH调节pH至5.0 加入0.65g叠氮化钠将dH <2> O添加到1 L
在使用前立即加入30μl100mM PMSF/ml提取缓冲液
注意：在调整pH之前，不要添加叠氮化钠。叠氮化钠的酸化将释放有毒气体。
0.1M乙酸钠缓冲液（pH5.0）将含有800ml dH 2 O的5.7ml冰醋酸（1.05g/ml）混合
用NaOH调节pH至5.0 加入0.65g叠氮化钠将dH <2> O添加到1 L

致谢

该协议改编自Zhao等人（2013）。

参考文献

Zhao，Y.，Song，D.，Sun，J.and Li，L。（2013）。山杨中β-甘露聚糖酶PtrMAN6在协调细胞壁重塑和抑制次生壁增厚中起作用通过产生寡糖信号。 Plant J 74（3）：473-485。