材料和试剂

鼠标与颅窗植入
盐酸丁丙诺非（Buprenex）（Butler Schein，目录号：031919）
异氟醚（Butler Schein，目录号：029405）
眼用软膏（Butler Schein，目录号：039886）
盖玻璃（no.0厚度）（Thomas Scientific，目录号：6661B40）
滤纸（Thermo Fisher Scientific，目录号：S47573B）
60mm培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：130181）
蒸馏水
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H7006）
人工脑脊髓液（ACSF）（见配方）
FITC-葡聚糖（Sigma-Aldrich，目录号：FD2000S）溶液（参见Recipes）
玫瑰红（Sigma-Aldrich，目录号：632-69-9）溶液（参见Recipes）

设备

胰岛素注射器，使用29.5号针（Thermo Fisher Scientific，目录号：309301），0.3ml体积
绿色激光，532nm（Beta Laser，目录号：MGM20）
带反馈调节的加热垫
1. 温度控制系统（FHC Inc.，目录号：40-90-8）
2. 直流热敏电阻（FHC Inc.，目录号：40-90-5D-02）
3. 用于鼠标的热垫（FHC Inc.，目录号：40-90-2-07）
异氟烷蒸发器（IsoTec4; Datex-Ohmeda）（GE Healthcare）
感应室（VetEquip，型号：941444）
物镜，4x，0.16-NA（UplanSApo）（Olympus或您的系统的等效物）
物镜，20x，1.0-NA浸水（XLUMPlanFI）（Olympus或您的系统的等效物）
双光子显微镜，适用于目标光血栓症（定制设计或商业化，即 Sutter可移动物镜显微镜）

显微镜设置

使用定制设计的双光子成像系统（Tsai等人，2002），用分色镜1（625DRLP）将绿色激光束引入成像光束路径（图1）（图1） Shih等人，2011）。调节光束以通过在分色镜2（700DCXRU）（图1）的电介质涂层中蚀刻的3.5mm直径的透明。这允许绿色激光器传输到物镜的后孔径，同时仍然反射> 90％的从样品朝向光电倍增管（PMT）的发射光。结果是固定的绿色激光束，聚焦在成像场的中心内。放置在绿色激光路径（LS3Z2 Uniblitz和VMM-D1驱动器）内的快门将允许控制其开关时间。在血管闭塞期间，可以针对短暂的成像时期周期性地中断照射。对于80％的占空比，通常为每1秒1帧（每帧0.2秒）。这允许实时观察凝块的形成（Schaffer等人，2006）。

（CW）连续波，（PMT）光电倍增管。图1.定制设计的双光子系统的示意图，其被修改以引入连续波绿色激光束。用于绿色激光的光束控制模块是指中性密度滤光器，以将激光强度衰减到适合于光血栓形成的水平。在二向色镜2的涂层中蚀刻直径为〜3.5mm的孔，以允许绿色激光器在PMT组件就位时通过，从而允许实时观察凝块形成。 Shih等人（2011）提供了用于适应针对性光致血栓形成的定制设计的双光子系统（Tsai等人，2002）的组件和说明书。 br />
对于商业双光子成像系统的封闭设计，显微镜内的附加光机械部件通常有有限的空间。这里我们说明如何使用由Sigler等人描述的定制绿色激光器模块通过Sutter可移动物镜显微镜（MOM）的相机端口引入绿色激光器。端口位于目镜上方，如大多数商业显微镜系统的情况（图2a）。该路径通向已经位于扫描透镜和管透镜之间的Ti-Sapphire成像光束路径内的可移动反射镜（反射镜2）。然后绿色激光器朝向物镜的后孔偏转。当使用MOM系统从双光子成像模式转换到广视场成像模式时，内置伺服电机将反射镜2移动到光束路径中，并且将物镜上方的主二向色同步地移出路径（图2a）。这允许绿色激光器传递到物镜。然而，在这种构造中，人们将不能实时地可视化凝块的形成。相反，当绿色激光器关闭时（图2b），通过转变回到双光子成像模式，在连续照射的时期（30秒）之间监测凝块的程度。最后，虽然这里没有讨论，但是绿色激光器的另一个入口点是通过落射荧光滤光器槽，如Sigler等人（ 2008） />

图2.修改为通过相机端口引入连续波绿色激光束的商用双光子系统（Sutter可移动物镜显微镜）的示意图。光束控制模块是指中性密度滤光器，激光强度到适合于光血栓形成的水平，以及在旋转支架上的偏振滤光片，用于更精细地调节强度（参见Sigler等人，2008，关于绿色的详细说明相机端口激光组件）。单个平凸透镜而不是Sigler等人描述的透镜双合透镜2008被添加到光学笼组件以确保光束在穿过显微镜的管透镜之后被准直。光束控制模块和透镜容纳在从Newport部件产生的光学笼中，该光学笼被螺栓连接到适配到相机端口中的C-mount适配器。 PMT组件移出成像光束路径，以允许绿色激光通过。
对于定制和商业双光子成像系统，根据系统，可能需要附加的光学器件来调节绿色激光器的功率并修改光束的直径。功率控制通常通过在旋转座架上添加中性密度滤波器和/或偏振器滤波器来实现（Sigler等人，2008; Shih等人，2011）。绿色激光在显微镜物镜后的焦点处的功率应在0.5-1mW之间。绿色激光束应当填充显微镜物镜的后孔径，以便在成像平面的中心内产生相对大的3至5μm直径的光活化区域。光束还应该被准直，以确保绿色激光在成像平面处聚焦。因此，可能需要增加透镜以改变光束直径和/或调整由光束路径内的其它透镜引起的绿色激光器的会聚/发散。例如，对于Sutter MOM系统，添加了附加的平凸透镜（LA1978-A）以减少由管透镜（图2a;位于光学笼系统内）引起的会聚。所有必要的光学器件可以使用可从ThorLabs或Newport获得的笼系统与绿色激光器一起容纳，然后作为单个单元安装在照相机端口上，类似于Sigler等人。（图2a）（Sigler等人，2008）。
我们现在描述涉及使用通过Sutter MOM的相机端口耦合的绿色激光束在小鼠皮质中阻塞单个穿透小动脉的过程。

程序

瞄准绿色激光
1. 在成像之前，通过漂白一块用FITC-葡聚糖溶液浸泡的滤纸来定位成像平面内的绿色激光的焦点。
2. 切一个1×1厘米的滤纸，并将其放在培养皿中。用50μl的FITC-葡聚糖覆盖纸并用盖玻片覆盖。将一滴蒸馏水滴在盖玻片的表面上，使滤纸在目镜处聚焦。
3. 使用与用于光血栓形成（即，20x，1.0-NA）相同的物镜。使用翻译平台找到没有气泡的区域。关闭PMT并转换到宽视场模式。确保摄像头端口打开，绿色激光通过物镜。
4. 照射样品30秒，然后停用光束。转换回双光子成像模式。滤纸的一个区域现在应该被漂白，标记绿色激光束的焦点。
5. 在计算机屏幕上的漂白区域放置一条清晰的磁带。使用笔标记激光聚焦的位置。在不同的位置重复漂白程序，以确保辐照位置是一致的。
光血栓
1. 该过程需要通过去除颅骨的光学接入，其已经在过去的出版物中详细描述（Mostany和Portera-Cailliau，2008; Drew等人，2010; Shih >等人，2012a; Shih等人，2012b）或变薄的颅骨窗口（Holtmaat，2009）。还需要固定小鼠头部用于成像的方法（Shih等人，2012b）。
2. 用异氟烷麻醉小鼠并将动物的头部固定在光学成像装置中。该装置应当具有连续递送异氟烷以在整个程序中提供麻醉的方法
3. 管理25微升的FITC葡聚糖通过尾静脉或眶后静脉标记血清。
4. 使用低放大率物镜（，即4x，0.16-NA），取通过颅窗的软膜脉管系统的图像堆叠（200μm深，5μm步长）。此堆叠的最大投影图像用作地图，以在使用较高放大倍数的物镜时提供指导（图3a）
  
  图3.通过小鼠皮质中的靶向光血栓形成产生皮层微梗塞。 a。低放大率，通过减薄的头骨PoRTS窗口可视化的血管脉管系统的最大投影图像（Drew，2010）。脉管系统用静脉内FITC-葡聚糖标记。识别窗内的单个穿透性小动脉用于光血栓形成（插图）。 b。在静脉内施用玫瑰红后立即单个穿透性小动脉（左图）的绿色激光照射导致局部凝血（右图）。成功的光血栓形成后，在照射部位看到黑色凝块，并且由于红细胞流动的停滞，血管在上游变得更亮。 C。使用泛神经元标记物NeuN的尸体后的免疫组织化学分析在闭塞后48小时观察到的所得微梗死（黄点线）的边界。
5. 更换用于高放大率物镜的低倍率镜头（，即，20x，1.0-NA）。将一滴蒸馏水放在颅窗上，并使唾液表面聚焦。使用低放大倍数物镜的图像在颅窗内导航。在下降到皮层之前，找到穿透性小动脉的颈部。穿透性小动脉从表面小动脉网络分支并下降到大脑中（Blinder，2010; Shih，2013）。要确认目标的身份，使用双光子显微镜成像更深层的皮质，并确保它渗透到大脑。一旦验证，返回到表面并通过移动显微镜载物台将绿色激光焦点的位置操纵到目标血管的管腔中。
6. 通过尾静脉或眶后静脉注射50μl玫瑰红溶液。立即用绿色激光焦点照射容器30秒。返回双光子成像模式。船舶现在应该堵塞。成功阻塞的血管将不显示由红细胞运动引起的暗条纹。通常会有黑色血栓，明亮区域的血清停滞在直接上游（图3b，右图）。如果血管未闭塞，可以重复光血栓形成程序。辐照必须在静脉注射玫瑰红后5至10分钟内进行，因为染料从循环中迅速渗出（Zhang和Murphy，2007）。该容器应在1小时后重新检查，以确保容器尚未脱出。有时可能会发生大穿透性小动脉的闭塞
7. 单个穿透性小动脉的闭塞将导致直径在300至500μm范围内的小鼠皮质中的缺血的柱状区域，并且通常可跨越皮质的整个深度（Drew等人，2010）。这种局部缺血区域最终将梗塞，并且可以用事后免疫组织学（图3c）描绘活的和梗死的组织之间的离散边界。

食谱

人工脑脊液（ACSF）
准备：
125 mM NaCl 5 mM KCl
10mM葡萄糖 3.1mM CaCl 2。 1.3mM MgCl 2
10mM HEPES（pH 7.4）
无菌过滤并保持在4°C等分试样（Kleinfeld和Delaney，1996）
FITC-葡聚糖溶液制备5％溶液（w/v）的无菌PBS
保持等分于-20°C
玫瑰红溶液
制备1.25％溶液（w/v）的PBS
保持等分于-20°C

致谢

我们的工作慷慨支持A.Y.S.赠款。来自NINDS（NS085402），Dana基金会和南卡罗来纳州临床和转化研究所（UL1TR000062）。

参考文献

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Drew，P.J.，Shih，A.Y.，Driscoll，J.D.，Knutsen，P.M.，Blinder，P.，Davalos，D.，Akassoglou，K.，Tsai，P.S.and Kleinfeld，D。（2010）。慢性通过抛光和加强的薄颅骨进行光学访问。 7（12）：981-984。
Kleinfeld，D。和Delaney，K.R。（1996）。在电压敏感染料显示的体感皮层上层中的vibrissa运动的分布式表示。 a> J Comp Neurol 375（1）：89-108。
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Nguyen，J.，Nishimura，N.，Fetcho，R.N.，Iadecola，C.and Schaffer，C.B。（2011）。皮质上行小静脉的阻塞导致血流量减少，血流方向逆转，上游毛细血管扩张。 J Cereb Blood Flow Metab 31（11）：2243-2254。
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Zhang，S。和Murphy，T.H。（2007）。成像皮质微循环对突触结构和感觉诱发的血液动力学反应的影响在体内。 PLoS Biol 5（5）：e119。