材料和试剂

NHEJ感受态人细胞（例如AHH1淋巴母细胞样细胞，Nalm6前B细胞，HeLa上皮细胞，MRC5SV成纤维细胞等）。
通过PCR扩增的〜500bp的双链DNA片段，在一端生物素化或非生物素化的
[³² P] -ATP
T4多核苷酸激酶
链霉亲和素顺磁珠（Dynabeads M280链霉亲和素）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：112.06D）
葡萄糖
己糖激酶（Calbiochem，目录号：376811）
PBS
三乙醇胺
醋酸镁
二硫苏糖醇
BSA（例如酶限制反应级）
乙酸钾
EJ缓冲区（参见配方）

设备

PCR热循环仪
闪烁计数器
热块（Eppendorf Thermomixer ^®舒适）

程序

首先，使用PCR与非生物素化或生物素化的反向引物和非生物素化的正向引物合成〜500bp的dsDNA片段（例如来自pBluescript质粒的），产生在一端生物素化的片段（500生物）。然后在[32 P] -ATP（500）的存在下用T4多核苷酸激酶放射性标记非生物素化的片段。
接下来，制备与生物素化DNA片段相关的珠子：每点，将0.5pmol 500生物dsDNA片段固定在10μl链霉抗生物素蛋白顺磁珠上，如制造商所推荐。
同时，使用来自人细胞的NHEJ感受态细胞提取物（Bombarde等人，2010）。简言之，通过在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中的三个冻/融循环裂解指数生长的细胞，然后裂解物在4℃孵育20分钟，通过离心澄清，并如所述的透析缓冲液透析（Bombarde > et al。，2010）。使用Bradford测定法测定蛋白质浓度，将末端连接提取物储存在-80℃。这里，将40μg提取物在30℃下用2mM葡萄糖和0.2U己糖激酶温育10分钟。葡萄糖和己糖激酶是用于预防的ATP消耗系统任何连接活性（Calsou等人，2003）。
注意：DNA末端突触是NHEJ的早期步骤，其依赖于蛋白质/DNA相互作用并且是可逆的（例如通过用高盐或洗涤剂洗涤），而连接是最后步骤并且是不可逆的（耐苛性洗涤）。必须防止结扎以将分析集中在突触上。
将10μl模拟（对照）或DNA处理的珠子在100μl的0.5×PBS中洗涤两次
将湿的模拟或DNA处理的珠子在16℃下在含有0.1pmol放射性500×DNA片段和40μg如上所述预温育的NHEJ感受态细胞提取物的10μlEJ缓冲液中混合30分钟。每5分钟轻轻地手动搅拌小珠。
孵育后，取出上清液保存，并将湿珠在50μl0.5x PBS中洗涤两次。
洗涤液与上清液合并。
在闪烁计数器中测量与上清液和珠子相关的放射性。
结果表示为减去样品中的计数（在珠上没有500个生物）时下拉的放射性的％（图1）。

图1.在突触条件下在体外用Nalm6或N114细胞的提取物下拉的比放射性的定量。 N114细胞在Lig4表达中具有影响突触的缺陷形成

食谱

EJ缓冲区
50mM三乙醇胺（pH8.0） 0.5mM乙酸镁 1mM二硫苏糖醇 0.1mg/ml BSA
60mM乙酸钾

致谢

末端突触协议改编自报道的测定（DeFazio等人，2002）。该工作部分地由来自La Ligue Nationale Contrele Cancer（Equipelabellisée），Electricitéde France（EDF ，Conseil de Radioprotection）和国家竞争研究所（XXL-屏幕计划）。 J. Cottarel获得了La Ligue Nationale Contrele Cancer的博士研究生支持。 P. Calsou是法国INSERM的科学家。

参考文献

Bombarde，O.，Boby，C.，Gomez，D.，Frit，P.，Giraud-Panis，M.J.，Gilson，E.，Salles，B.and Calsou， TRF2/RAP1和DNA-PK介导对端粒末端连接的双重保护。 EMBO J 29（9）：1573-1584。
Calsou，P.，Delteil，C.，Frit，P.，Drouet，J。和Salles，B。（2003）。 DNA末端DNA依赖性蛋白激酶的Ku和p460亚基的协调装配对于XRCC4是必需的 - 寡核苷酸IV募集。 J Mol Biol 326（1）：93-103。
Cottarel，J.，Frit，P.，Bombarde，O.，Salles，B.，Negrel，A.，Bernard，S.，Jeggo，PA，Lieber，MR，Modesti，M.and Calsou，。非同源末端连接期间连接复合物的非催化功能。细胞 Biol 200（2）：173-186。
DeFazio，L.G.，Stansel，R.M.，Griffith，J.D.and Chu，G。（2002）。 DNA末端的突触由DNA依赖性蛋白激酶引起。 /em> 21（12）：3192-3200。