材料和试剂

新鲜土壤或土壤储存在-80°C
RNA PowerSoil Total RNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories，目录号：12866-25）
苯酚/氯仿/异戊醇25:24:1（pH6.7）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP17521-400）
焦碳酸二乙酯（DEPC）（Sigma-Aldrich，目录号：D5758-50mL）
RNase AWAY ^®（VWR International，目录号：72830-022）
一次性手套
冰块
DEPC水（见Recipes）或无核酸酶水

设备

Fisher Vortex Genie 2（VWR International，型号：12-812）
离心机（Sorvall SuperT21转子SL-50T）（用于15ml离心管）
微量离心机（VWR International，型号：Galaxy 16）
Shaker（New Brunswick Scientific，型号：G-33）
孵育器设置在45°C
5ml硼硅玻璃移液管（VWR International，型号：53281-818）
1000μl移液器
200μl移液器
2.5μl移液器
-20°C冰箱
4°C孵育器
微量离心机管架（VWR International，型号：CBGTR-080）
15 ml falcon管夹
实验室标签带（VWR International，目录号：89097-902）
分光光度计（例如Thermo Scientific，型号：NanoDrop ND-1000）

程序

注意：在整个方案中使用一次性手套，并经常更换手套。带RNase的喷手戴手套去除RNases。您还可以使用口罩来减少RNase对样品的污染。

总RNA分离试剂盒版本02162010。

RNA分离
1. 使DEPC水至少2天前使用。
2. 在你的土壤RNA提取的一天，确保用RNase Away清洁你的工作台。这包括所有的移液器和支架
3. 设置从RNA PowerSoil ^TM总RNA分离试剂盒的珠管，并添加存储在-80℃的冻土。
4. 向珠子管中加入2.5ml珠子溶液，并通过涡旋混合溶液。
5. 向珠子管中加入0.25ml标记为SR1的溶液，并通过涡旋混合溶液注意：此时的解决方案应该看起来很均匀，并且具有泥泞的一致性。
6. 向珠管中加入0.8ml标记为SR22的溶液，并通过涡旋混合溶液
7. 将管子水平放置在涡流器上，并使用实验室标签带将管子固定在涡流器上
8. 涡旋管以最大速度30分钟（从原始方案修改步骤，以便更容易和有效地去除会干扰RNA分离和裂解细胞的非DNA材料）。
9. 从试管和涡流器中取出实验室标签带，将试管放在支架上
10. 使用5ml硼硅玻璃吸管，加入3.5ml苯酚：氯仿：异戊醇，pH6.7，通过上下颠倒10次混合溶液。
11. 将管子在振荡器上水平固定，并以200rpm摇动溶液30分钟（从原始方案修改的步骤，以防止RNA剪切，影响RNA完整性和浓度）。
12. 从摇床上取下胎管，并在室温下以2,500×g离心10分钟。
13. 使用1000微升移液器转移水（上）层到新的干净的15毫升falcon管提供在RNA PowerSoil总RNA分离试剂盒。确保你只采取顶层并且最好留下一些水层以确保没有相间或下层转移。
14. 向含有上层水相的新管中加入1.5ml标记为SR3的溶液。关闭管并翻转10次
15. 在4℃下孵育10分钟。
16. 离心管在室温下以2,500×g离心10分钟。
17. 有时在此步骤后形成沉淀，因此只是为了将上清液转移到使用1000μl移液管提供的新的15ml falcon管中。
18. 使用5毫升硼硅玻璃移液管转移5毫升溶液SR4到新的收集管。关闭管并翻转10次
19. 将管在-20℃下孵育30分钟
20. 离心管在室温下以2,500×g离心30分钟。
21. 倾析上清液。
22. 在室温下以2,500×g再次离心该管5分钟。
23. 使用1000μl移液管除去任何残留的上清液，不要打扰沉淀
24. 让管子干燥5分钟。
  注意：颗粒可能是白色，灰色或浅棕色。
RNA纯化
1. 摇动溶液SR5。
2. 一旦颗粒干燥，向管中加入1ml溶液SR5，通过颠倒和摇动溶液混合
3. 如果沉淀物未溶解于溶液中，SR5在45℃下孵育并每2分钟检查管子并摇动溶液。
4. 重复，直到颗粒溶解在SR5溶液中注意：溶液可以是透明的或棕褐色的。
5. 颗粒溶解后，在一个新的15ml falcon管中提供一个RNA捕获柱
6. 摇动溶液SR5，并将2ml溶液SR5加入RNA捕获柱
7. 使溶液SR5重力流过色谱柱。
8. 一旦溶液SR5已经到达柱中树脂的顶部，将溶解的沉淀物加入柱中并允许其重力流过柱。
9. 一旦溶解的颗粒已经达到柱树脂摇动溶液SR5的顶部，并向柱中加入1ml溶液SR5，并允许其重力流过柱。
10. 一旦溶液SR5已达到柱树脂的顶部，摇动溶液SR6，并向柱中加入1ml。
11. 立即将色谱柱转移到新的15 ml falcon管中。
12. 使溶液SR6流过该柱。
13. 将洗脱的RNA转移到试剂盒提供的2.2ml收集管中
14. 加入1毫升溶液SR4到2.2毫升收集管和倒转管混合10次
15. 将管在-20℃下孵育20分钟
16. 将管在4℃下以13,000×g离心15分钟。
17. 你应该能够在管子的一边看到一颗颗粒。颗粒可以是白色或棕褐色。
18. 倾析上清液。
19. 在4℃下以13,000×g离心管5分钟。
20. 小心地使用200μl移液管而不接触沉淀物，从管中除去剩余的上清液
21. 让管在空气中干燥5分钟。
RNA样品的评价
1. 将RNA沉淀重悬在30μl溶液SR7中。
2. 将收集管放在冰上。
3. 使用分光光度计确定RNA的浓度，用于RNA浓度也可以监测A 260/280以确定RNA完整性（如果1.8-2.0 RNA之间的A 260/280是高质量的进一步下游应用）。
4. 通过使用琼脂糖凝胶检查RNA完整性。

食谱

DEPC水
每升Millipore水中加入1ml焦碳酸二乙酯
搅拌溶液过夜
在液体循环中高压灭菌溶液30分钟
让溶液冷却至室温
储存在室温下

致谢

工作得到国家科学基金会授予J.M.V.的资助。（MCB-0950857）。

参考文献

Chaparro，J.M.，Badri，D.V.，Bakker，M.G.，Sugiyama，A.，Manter，D.K。和Vivanco，J.M。（2013）。拟南芥中植物化学物质的根渗出遵循具有发育程序并与土壤微生物功能相关的特定模式。
8（2）：e55731。
MoBio RNA PowerSoil ^® Total RNA Isolation Kit使用手册版本02162010