材料和试剂

Jurkat T细胞（ATCC，目录号：TIB-152）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：472301）
RPMI培养基1640（Life Technologies，Gibco ，目录号：21875-034）
胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：16000044）
青霉素/链霉素（pen/strep）（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-122）
PMA（Sigma-Aldrich，目录号：P1585）（-20℃保存）
离子霉素（Sigma-Aldrich，目录号：I0623）（-20℃保存）
钙测定试剂盒（BD Biosciences，目录号：640176）
完成RPMI媒体（参见配方）
PMA储备溶液（见配方）
离子霉素储备溶液（见配方）

设备

离心机（Eppendorf，型号：5810R）
37℃5％CO 2细胞培养箱
单元格计数器
BD CantoII FACS机器
5ml圆底FACS管（BD Biosciences，目录号：352003）

软件

FACS DIVA软件
FlowJo软件

程序

制备（对于4个样品）
1. Jurkat T细胞的制备：
  1. 计数细胞指数生长（每次测定1×10 6次）
  2. 用预热的完全RPMI培养基在200×g下洗涤细胞5分钟。
  3. 将1×10 6个细胞/250μl新鲜完全RPMI培养基置于5ml FACS管中。
2. 1x增强溶液（来自钙测定试剂盒）（2ml，用于4次测定）的制备：
  1. 混合200μl的10倍增强溶液与1.8毫升测定缓冲液
  2. 保持室温。
3. 指示剂的制备（来自钙测定试剂盒）：
  1. 平衡指示器（储存在-20℃）在室温下5分钟。
  2. 加入100μl的100％DMSO。
  3. 通过多次上下吹吸混匀。
  4. 在室温储存10分钟以完全稳定。
  5. 将未使用的指示物储存在-20℃的小份中直至使用。
4. 1×装载染料的制备：
  混合2毫升1x增强溶液与2微升上面制备的指标。
5. 加载染料到细胞：
  加入250微升1x加载染料（在步骤4中制备）到每个含有细胞的管中。
6. 在37℃CO 2孵育器中孵育管1小时。
7. 在室温下冷却管20分钟，然后分析
FACS分析
1. 打开FACS DIVA软件。
2. 绘制点图（时间在X轴，FITC在Y轴）。
3. 将管插入FACS机器。
4. 单击"记录数据"1分钟以获得基础水平的信号
5. 单击"停止获取"并从FACS机器中取出试管。
6. 立即加入1μl刺激剂[PMA（50ng/ml）和离子霉素（1μg/ml）的混合物]。
7. 短暂涡旋并将管放回FACS机器。
8. 再点击"记录数据"3分钟。
9. 单击"附加"将获取的信号附加到步骤4中获取的信号的1分钟基础水平。
10. 单击"停止采集"完成测定。
11. 通过选择动力学模式，用FlowJo软件分析每个数据。
12. 将控制数据上的样本数据重叠显示，如图1所示，在一个图上显示控件和样本之间的信号差异。
  
  图1.细胞内Ca ^{2 +} 在IKKγ/NEMO缺陷型Jurkat T细胞中的流入与Ha标记的IKKγ/NEMO WT或突变体（S377E，S377A，Y374D，Y374F）。在37℃下用Ca 2+指示剂加载细胞1小时。通过流式细胞术分析监测在PMA和离子霉素（P + I）处理上的细胞内Ca 2+流入5分钟。 Vec代表矢量控制。

食谱

完成RPMI媒体
含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI
PMA储备液
50ng/ml DMSO
离子霉素储备液
1μg/ml DMSO

致谢

该协议改编自Lee等人（2012）。

参考文献

Lee，S.H.，Toth，Z.，Wong，L.Y.，Brulois，K.，Nguyen，J.，Lee，J.Y.，Zandi，E.and Jung，J.U。 IKKγ/NEMO的新型磷酸化 MBio 3（ 6）：e00411-00412。