材料和试剂

RPMI-1640培养基（Life Technologies，Gibco ，目录号：11875-093）
FBS（Hyclone，目录号：SH30396-03）
青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺溶液（Life Technologies，Gibco ，目录号：10378-016）
2-巯基乙醇（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：21985-023）
佛波醇12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）（Sigma-Aldrich，目录号：79346）
离子霉素（Sigma-Aldrich，目录号：19657）
5（和-6） - 羧基荧光素二乙酸酯，琥珀酰亚胺酯（5（6）-CFDA，SE）（CFSE）（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：C1157）
7-羟基-9H-（1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮（DDAO）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：C34553）
5-（和-6） - （（（4-氯甲基）苯甲酰基）氨基）四甲基罗丹明（CMTMR）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：C2927）
16％多聚甲醛溶液（PFA）（16％甲醛，EM级）（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）
Vectashield Hardset with Dapi（VWR International，目录号：101098-050）
在H 2 O中的0.1％（w/v）的聚-L-赖氨酸溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P8920）
SL8（卵白蛋白（257-264））（AnaSpec，目录号：60193）
PBS（Life Technologies，目录号：14190-44）
媒体（见配方）
2％PFA（参见配方）
聚-L-赖氨酸涂层室（见配方）

设备

离心机
流式细胞仪
荧光显微镜
37℃，5％CO 2细胞培养箱
24孔板（Corning，Costar ，目录号：3524）
40μm细胞过滤器（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352340）
FACS管，聚苯乙烯（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352054）
8孔腔室载玻片（Thermo Fisher Scientific，Lab-Tek ^{TM，目录号：177445）}

程序

T-APC共轭测定
注意：
1. 该方案使用来自未免疫小鼠的纯化的OT-I CD8 + T细胞，其是对于识别鸡卵OVA来源的SIINFEKL的TCR是转基因的肽（SL8）在MHC I类分子H2-k抗体的上下文中。一样方案可以与对其他抗原特异的T细胞一起使用。 BMDC （骨髓来源的树突状细胞）用作APC，但DC来自其他来源或许多细胞系，可用作APC。
2. 一旦细胞被标记，它们应该尽可能地避免光。
1. 细胞标记：以10×10 6个细胞/ml（通常在2ml中为20×10 6个细胞）的浓度在PBS中重悬悬BMDC和纯化的初始OT-I细胞，。在BMDCs上加入终浓度为4μM的DDAO，在OT-I细胞上加入终浓度为1μM的CFSE。在37℃，5％CO 2孵育30分钟注意：CFSE和DDAO可以替代其他染料。使用这两种染料的优点是需要在流式细胞仪上几乎没有补偿。
2. 通过在室温下以300xg离心5分钟，用5体积的培养基（如果开始于20×10 6个细胞，则为10ml）洗涤细胞三次。 />
3. 脉冲APC：以10×10 6个细胞/ml的浓度将BMDC重悬在培养基中。加入SL8，终浓度范围为0-1,000ng/ml（通常使用5种不同浓度），并在37℃，5％CO 2下孵育60分钟。
4. 虽然APC是抗原脉冲，将OT-I细胞以4×10 6个细胞/ml重悬于培养基（通常为5ml中的20×10 6个细胞）中。每个FACS管添加50微升OT-I细胞。离开细胞在37℃5％CO 2，直到APC准备好。
5. 通过在室温下以300xg离心5分钟，用5体积的培养基洗涤BMDC三次。
6. 在培养基中以4×10 6个细胞/ml重悬BMDC
7. 向每个含有OT-I细胞的FACS管中加入50μl的BMDCs。立即以228×g（1,000rpm）在20℃下旋转1分钟。立即置于37℃。
  注意：在这个协议，T细胞APC比例是1，但你可以使它变化。孵育时间通常为0-60分钟（0-10-20-30-60分钟）。
8. 固定细胞：一旦所需的时间量完成，加入100μl每个样品的温暖（20°C）2％PFA。非常轻轻地混合，通过上下吹吸或快速涡旋低。在室温（约20℃）孵育10分钟。
9. 在流式细胞仪上运行。基于双重CFSE/DDAO阳性评估偶联的百分比（图1）。
  
  图1.T-APC偶联测定 - 实施例。 CFSE标记 OT-I细胞在37℃下与DDAO标记的BMDC一起孵育30分钟其用0（左图）或100ng/ml（右图）SL8脉冲肽。首先使用SSC/FSC门（上部）排除细胞碎片面板）。耦合单元是DDAO ⁺和CFSE ⁺。
T-T聚类测定
注意：
1. 在该方案中，T细胞用PMA和离子霉素活化旁路对APC的需要和每个T细胞可以被激活办法。然而，相同的协议可以用于与激活的T细胞 APC，抗CD3和抗CD28等...
2. 作为示例，该协议比较OT-1细胞的容量缺乏整合素ICAM-1形成同型相互作用与对照OT-I细胞相比。但是可以使用相同的协议调查T细胞聚集，阻断抗体等的动力学。
1. 细胞标记：以10×10 6个细胞/ml（通常是2ml中的20×10 6个细胞）的浓度将纯化的OT-I细胞重悬在PBS中。在对照细胞上加入终浓度为1μM的CFSE，在ICAM-1 -/- 细胞上加入终浓度为4μM的CMTMR。在37℃，5％CO 2孵育30分钟
2. 通过在室温下以300×g离心5分钟，用5体积的培养基洗涤细胞三次。
3. T细胞活化：以2×10 6个细胞/ml的浓度在培养基中重悬OT-1细胞。 WT和ICAM-1 -/- 细胞以比率1混合，然后通过在培养基中直接加入5ng/ml PMA和50ng/ml离子霉素来活化细胞。在24孔板的每孔中铺板2ml细胞悬浮液
4. 活化后16至24小时，通过流式细胞术（步骤B5）或显微镜（步骤B6）分析聚类中的细胞百分比。
5. 通过流式细胞术分析：通过在20℃下加入相同体积的2％PFA 10分钟来固定细胞。固定的细胞通过40μm过滤器进入FACS管。经过的细胞代表"非聚集"部分。保留在过滤器上的细胞用1ml PBS 2mM EDTA（以破坏细胞簇）洗涤并代表"聚集的"级分。两种级分在流式细胞仪上运行（图2）
  
  图2.T-T聚类分析 - 通过流式细胞术分析。将CFSE标记的WT OT-I细胞和CMTMR标记的ICAM-1-OT-I细胞混合并用PMA和离子霉素刺激。活化后24 h，聚集的细胞通过40μm过滤器与非聚集的细胞分离，并通过流式细胞术分析两种级分。首先使用SSC/FSC门排除细胞碎片（上图）。聚集的细胞 - 左图;非聚簇细胞 - 右图。
  注意，与WT细胞相比，ICAM-1缺陷细胞主要存在于非聚集的细胞部分中。
  注意：切割移液管吸头的尖端，以确保细胞群集在过滤器上应用细胞悬浮液时不会因移液而受到破坏。
  体外活化的T细胞通常形成直径大于40μm的簇，因此应该保留在过滤器上。然而，穿过过滤器的细胞可能是较小簇的一部分。因此，有用的是将流式细胞术数据与显微镜定量比较。
6. 通过显微镜分析：将细胞（通常300μl的细胞悬浮液）转移到聚-L-赖氨酸包被的室上，并在37℃，5％CO 2下孵育10分钟。然后小心地除去培养基并用200μl的2％PFA替换。 10分钟后，小心地除去PFA，并用200μlPBS代替。取出PBS，让其干燥2分钟。取下腔室垫圈，并用一滴Vectashield在盖玻片上安装。用epifluorescent显微镜分析注意：切割移液管吸头的尖端，以确保在将细胞悬浮液应用于培养室时，细胞群不会被移液管破坏。

食谱

媒体（555毫升）
500ml RPMI Medium 1640
50ml热灭活（56℃30分钟）FCS
500μl50mMβ-巯基乙醇 5ml青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺溶液保持在4°C
2％PFA
稀释1ml的16％PFA溶液在7ml PBS中
在4℃黑暗中保持
聚-L-赖氨酸涂层室
稀释聚-L-赖氨酸储备溶液1/100 in dH 2 sub *
在每个室中加入500μl
在RT孵育5-10分钟
用dH 2 O彻底清洗，并让室干燥至少2小时
室内可以在RT储存数周，

致谢

该协议改编自以前发表的论文Gerard等人（2013）。该方案在Matthew F.Krummel的实验室中改编，并且得自幼年糖尿病基金会（MFK）和NIH R01AI52116（MFK）的赠款。

参考文献

Gérard，A.，Khan，O.，Beemiller，P.，Oswald，E.，Hu，J.，Matloubian，M.and Krummel，M.F。次级T细胞-T细胞突触相互作用驱动保护性CD8 + T细胞的分化。 Nat Immunol 14（4）：356-363