材料和试剂

粘附的肿瘤细胞[例如非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系]
特异性T细胞克隆（由自体肿瘤浸润性T淋巴细胞（TIL）或外周血淋巴细胞（PBL）产生）
RPMI 1640（Life Technologies，Gibco ，目录号：61870044）
DMEM-F12（Life Technologies，Gibco ，目录号：31331093）
UltroserG（Pall，目录号：15950-017）
胎牛血清（Life Technologies，Gibco ，目录号：10270-106）
人血清AB（Institut de Biotechnologies Jacques Boy）
青霉素和链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140122）
丙酮酸钠（Life Technologies，Gibco ，目录号11360029）
IL-2
10x PBS（Life Technologies，Gibco ，目录号：70011-036）
CellTracker探针（CellTracker TM Green CMFDA）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：C2925）
完全DMEM：肿瘤细胞培养基（LC培养基）（参见配方）
基于RPMI的T细胞完全培养基（参见配方）

设备

具有加热孵育室和CO 2供应的显微镜Zeiss LSM-510（ZEISS）
Micro-Slides VI，ibiTreat（ibidi GmbH，目录号：80606），两个具有塑料夹的硅管（1.6mm内径），两个Elbow Luer连接器（ibidi GmbH，目录号：80646）
注射泵（高流速> 50ml/min）
60ml注射器（Becton，Dickinson and Company，目录号：300866）
在37℃，5％CO 2/h的湿化培养箱中
废物流缓冲区（Erlenmeyer）的收件人
离心机（Beckman Coulter，型号：GS-6R）

程序

粘附肿瘤细胞制备
1. 通过在LC培养基中加入60μl肿瘤细胞悬浮液将种子贴壁肿瘤细胞转入IBIDI通道。微滑动VI，ibiTreat的特点如下：
  通道数：6
  每个通道最小容量：30微升
  通道长度：17毫米
  通道宽度：3.8毫米
  通道高度：0.4 mm
  生长区域：每个通道有0.6厘米 2
  肿瘤细胞浓度可根据细胞类型（例如，对于参考文献1中描述的NSCLC细胞系为1.6×10 6个细胞/ml）而变化。在实验当天，细胞应达到90-95％的汇合
2. 孵育IBIDI幻灯片在潮湿的孵化器在37℃至少2小时细胞附着。
3. 轻轻地用另一个60微升的液体培养基填充水库。避免直接移液到通道中，以免分离细胞
4. 在37℃，5％CO 2孵育过夜。
  注意：在肿瘤细胞治疗（例如siRNA转染）的情况下，应该在使用相同的实验条件之前将细胞铺板两天。中等可能需要每24小时更换一次。确保细胞都存活，并且在实验当天达到90-95％汇合。
T细胞制备
1. 用PBS 1x洗涤T细胞，在350×g离心5分钟
2. 根据制造商的方案用CellTracker Green（CMFDA）染色细胞。简言之，将细胞以2×10 6个/ml的浓度重悬于PBS中，并加入一个体积的稀释在PBS（终浓度1μM）中的CellTracker Green（CMFDA 2x）。在37℃下孵育15分钟。
3. 通过在350×g离心5分钟，用基于RPMI的完全培养基洗涤T细胞两次。
4. 在T细胞培养基中重悬T细胞，最终浓度为2×10 6个细胞/ml，在24个平底孔板中。
5. 在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中培养T细胞过夜。
流动条件下的T细胞粘附强度
1. 第二天，将显微镜的恒温室在37℃和5％CO 2（图1A）温暖。
2. 在37℃和5％CO 2下，在培养箱内平衡基于RPMI的完全培养基（500ml）。
3. 准备注射泵（图1B）。
4. 将带有塑料夹子（位置关闭）的管连接到注射器，并用预热介质填充注射器。放入Elbow Luer连接器并灌注管（图1A）。
5. 将IBIDI载玻片（图1C）放在显微镜物镜（20x）下（图1D）。确保油箱完全充满。如果没有，请添加一些介质。
6. 将管连接到IBIDI通道的一个末端，确保内部没有残留气泡。这一步是关键，因为气泡增加了肿瘤细胞脱离的风险，影响流速，甚至可以停止流动。
  
  图1.流系统。 A。全流系统; B.泵系统; C.微滑块的细节IBIDI连接; D.在采集期间，载玻片在显微镜下固定并连接到泵系统。
7. 使用第二个管将通道的相对末端与瓶子收集废物连接（图2）。
  
  红色：粘附肿瘤细胞层
  绿色：T细胞
  蓝色：LC介质
  白色箭头：流向
  图2.流动条件下的T细胞粘附。将染色的T淋巴细胞在先前接种到IBIDI通道中的单层自体肿瘤细胞上孵育15分钟。 IBIDI载玻片然后通过硅管在一侧连接到泵（注射器装有预热介质），另一侧连接到废物接收器。
8. 释放将注射器连接到IBIDI载玻片的管上的夹子（图1A）。
  注意：测试系统以验证不分离肿瘤细胞的最大流速。该比率将用于确定肿瘤细胞上的T细胞粘附强度。
9. 通过在350×g离心5分钟用RPMI洗涤T细胞
10. 在RPMI培养基中重悬T细胞，最终浓度为2×10 6个细胞/ml。
11. 用50μlT细胞悬浮液替换填充通道的培养基。小心不要分离肿瘤细胞或在通道内引入气泡。
12. 在37℃孵育15分钟。
13. 孵育后，使用与测试分析相同的条件制备流动系统
14. 在注射器内加入50 ml预热的培养基
15. 在流动之前开始采集（图1D）。
16. 每2秒采集一次图像，持续60秒。预期T细胞比不表达这些分子的肿瘤细胞更牢固地粘附于表达粘附分子（例如由T细胞表达的整联蛋白的配体）的肿瘤细胞。（图3）
  
  图3.在T细胞粘附方案期间在不同时间采集的代表性图像。 A。 0秒; B. 250秒; C.流速为100ml/h时为640秒

食谱

完全DMEM：肿瘤细胞培养基（LC）
DMEM-F12补充：
10％补充胎牛血清
1％UltroserG
1％青霉素和链霉素 1％丙酮酸钠
基于RPMI的T细胞完全培养基
RPMI 1640，补充有10％人血清AB
1％青霉素和链霉素 1％丙酮酸钠 IL-2（100U/ml）

致谢

我们感谢SophieSalomé-Desmoulez对共聚焦显微镜的帮助。这项工作得到了INSERM，癌症研究协会（ARC），国家癌症研究所（INCa），癌症研究所和法兰西岛大学（IDF）的资助。 MB是来自CancéropôleIDF的奖学金的接受者。

参考文献

Bernard，G.，Raimondi，V.，Alberti，I.，Pourtein，M.，Widjenes，J.，Ticchioni，M.and Bernard，A。（2000）。 CD99（E2）在流动条件下上调α4β1依赖性T细胞粘附至发炎的血管内皮。 Eur J Immunol 30（10）：3061-3065。
Franciszkiewicz，K.，Le Floc'h，A.，Boutet，M.，Vergnon，I.，Schmitt，A.和Mami-Chouaib，F.（2013）。 CD103或LFA-1参与细胞毒性T细胞和肿瘤细胞之间的免疫突触促进成熟和调节T-cell effector functions。 Cancer Res 73（2）：617-628。
Rosenthal-Allieri，M.A.，Ticchioni，M.，Breittmayer，J.P.，Shimizu，Y。和Bernard，A。（2005）。 β1整合素胞质内结构域在VLA-4介导的人类T细胞粘附的调节中的影响VCAM-1在流动条件下。 175（2）：1214-1223。