材料和试剂

MCF-7细胞，源自转移部位的乳腺癌上皮细胞（ATCC HTB22 ^TM）。
HEK293T细胞
质粒
pLL5.0慢病毒载体（图1）和包装质粒pMDLg/pRRE，pMD2.G（VSV G）和pRSV-Rev。 pLL5.0是pLL3.7的修饰版本，并且由北卡罗来纳大学，Chapel Hill，NC 27599的细胞和发育生物学系的Jim Bear慷ously提供（Vitriol等人， 2007; Rubinson等人，2003）
（HpaI和XhoI）（图1）和小鼠E-钙粘着蛋白（NM_009864）的下游的包含针对人CDH1（NM_004360）（5'-GGGTTAAGCACAACAGCAA-3'）的ORF的shRNA的pLL5.0- GFP融合构建体克隆在SacII和SbfI位点。 E-钙粘蛋白-EGFP融合蛋白表达由5'LTR启动子驱动以促进用于成像的GFP融合蛋白的较低表达水平（Smutny等人，2011）。
（NM_001258315）（5'-GCTGTTTCAAAGTGTGATA-3'）的3'UTR的shRNA并在pLL5的修饰形式中克隆在U6启动子（HpaI和XhoI）的下游（图1）的pLL5.0。 0。在该修饰的pLL5.0中，GFP报告子被包含GFP的编码区和pEGFP-C1（Clontech）的多克隆位点的序列替换，使用EcoRI和SbfI位点。在该克隆步骤后，这些限制性位点不被保留。然后使用EcoR1和BamH1位点（pLL5.0GFP-shRNA抗性ECT2）将人类ECT2编码序列（NM_001258315）克隆到载体中

图1.pLL5.0载体的示意图。位点HpaI和XhoI用于亚克隆所需的shRNA序列，以敲除目的蛋白的内源水平。 U6启动子驱动该shRNA序列的表达。相反，相同蛋白的shRNA抗性版本可以亚克隆到5'LTR启动子的下游，并融合到GFP。因此，可以实现荧光标记的蛋白质的内源表达水平和预防与其过表达相关的效应。 MCS =多克隆站点
Dulbecco's Modified Eagle's Medium具有稳定的L-谷氨酰胺（DMEM）的高葡萄糖（Gibco，目录号：11995-073）
胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：26140079）
没有Ca 2+和Mg 2+的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Astral Scientific，目录号：09-8912-100）
16％多聚甲醛（甲醛）（PFA）水溶液（ProSciTech，目录号：C004）
Hank's平衡盐溶液（HBSS）（Sigma-Aldrich，目录号：H8264）
In-Fusion克隆试剂盒（Clontech，目录号：638909）
Hank's平衡盐溶液（Sigma-Aldrich，目录号：H8264）
2.5％胰蛋白酶（10x）（Life Technologies，目录号：15090046）注意：该溶液用PBS稀释至0.25％最终浓度。
聚（偏二氟乙烯）离心柱（Amicon Ultra离心过滤器，UltraCel-100K）（EMD Millipore，目录号：UFC910024）
丁酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：B5887）（参见Recipes）
六溴二苯醚（polybrene）（Sigma-Aldrich，目录号：H9268）（参见配方）
成像介质（参见配方）
4％的Paraformaldheyde在PBS（见配方）

设备

25cm 2 Nunclon Delta Flasks（Thermo Fisher Scientific，Nunc ，目录号：156367）
175cm 2 Nunclon Delta Flasks（Thermo Fisher Scientific，Nunc ，目录号：159910）
激光扫描共聚焦显微镜配备声光可调滤波器（AOTF）用于漂白所选区域和加热室（37°C）用于活细胞成像。显微镜还必须配备二向色和发射滤光器，用于使用405和488nm激光线和检测GFP荧光。所示的实验在LSM 510 Meta或LSM 710反向共聚焦显微镜（ZEISS）上进行
30mW氩（458,488和514nm激光线）和25mW（405nm）二极管激光器（LASOS Lasertechnik GmbH）
插件FRAP分析器（McMaster University，Canada）
玻璃底皿（＃1.5）（MatTek，目录号：P35G-1.5-20-C或Shengyou Biotechnology，目录号：D29-10-1.5-N）

软件

Image J软件
Prism，GraphPad
Matlab，MathWorks

程序

细胞制备
1. 在敲低背景中表达GFP标记的蛋白质
  我们在我们最近发表于Nature Cell Biology的文章（Ratheesh等人，2012）中使用这种方法来表征粘附分子E-钙粘蛋白的动力学性质和RhoA GEF，Ect2。为了在内源水平表达这些蛋白质，我们使用pLL5.0慢病毒载体（Vitriol等人，2007; Rubinson等人，2003）。该载体含有两个启动子，驱动shRNA表达的U6启动子和驱动shRNA抗性基因表达的5'LTR启动子（图1）。
2. 慢病毒制备和病毒转导
  1. 将HEK293T细胞在补充有10％FBS的20ml DMEM中在37℃下培养，并在以下步骤期间保持在这些条件下。
  2. 在pLL5.0载体中制备的构建体通过CaCl 2沉淀用包装载体同时转染到HEK-293T细胞中。
  3. 转染后48小时，用丁酸钠（10mM终浓度）处理细胞以增加基因诱导。
  4. 在转染后48-72小时收获病毒样颗粒（VLP），并如下在聚（偏二氟乙烯）旋转柱上浓缩：
    1. 收集细胞的培养基并在50ml锥形管中旋转
    2. 使用0.2μm注射器过滤器将上清液过滤到新管中
    3. 加入10ml滤液到聚（偏二氟乙烯）离心柱，并在台式离心机上在室温下以3,200rpm离心20分钟。这将使VLP的悬浮液体积减少到每管约800μl
    4. 弃去流槽，将剩余的上清液（约10ml）加入到聚（偏二氟乙烯）旋转柱中，并重复上述步骤。
    5. 随后将等分的病毒用于滴定或储存在-80℃。如前所述测定滴度（Smutny等人，2010）。
3. 制备用于图像采集的细胞
  1. 对于FRAP实验，将MCF-7细胞在补充有10％FBS的DMEM中培养，并在25cm 2烧瓶上以每个细胞10个感染复数感染慢病毒颗粒。
  2. 将细胞在37℃下与慢病毒在DMEM + FBS和聚凝胺（Polybrene）（8μg/ml）中温育，并在感染后三天通过胰蛋白酶消化收获。
  3. 将单细胞悬浮液以80％汇合度接种在玻璃底培养皿上，并允许生长48小时（或直到它们达到完全融合）用于FRAP实验。
  4. 在图像采集之前，用成像介质洗涤细胞，并在实验期间用1.5ml孵育
图像采集
1. 在用于E-钙粘蛋白-GFP或GFP-Ect2的LSM 510 Meta或LSM 710 Zeiss共聚焦显微镜上分别进行FRAP实验。显微镜配备有保持在37℃的加热台和30mW氩激光器（458,488和514nm激光线）。 LSM 710 Zeiss共聚焦显微镜还配备有405nm（25mW）二极管激光器。使用60倍物镜，1.4NA油平面Apochromat浸没透镜以4x数字放大倍率，0.7μm光学截面获得图像（漂白前和漂白后，图1）。氩激光器（30mW）的488nm激光线用于1-3％透射的荧光激发
2. 对于E-钙粘蛋白-GFP动力学，在光漂白之前和之后以每帧5秒的间隔获得延时图像（416×416像素，0.086μm/像素），总时间为280秒（图1A）。对于每个实验，标记2.8×1.7μm的恒定的感兴趣区域（ROI），其中平行于细胞 - 细胞接触的较长轴，并且用具有100％透射的488nm激光的50次重复漂白E-钙粘蛋白-GFP。这导致大约70％的最大漂白。
3. 使用通过慢病毒感染与Ect2shRNA共表达的GFP-Ect2评估Ect2动力学。在大约细胞 - 细胞接触的中心的恒定圆形ROI（1.4μm直径）漂白至〜70％，同时488和405nm激光在100％透射率同时开启。在（20帧，5秒）之前和之后（210帧，50秒）获得相同区域的延时图像，间隔〜250 m每帧（图1B）。
4. 对于这些实验，选择具有倾斜接触的细胞，其允许我们精确地鉴定和光漂白ZA
  特殊注意事项
  1. 对于任何实验设置，重要的是考虑漂白过程和获取的频率必须匹配感兴趣的蛋白质的动力学（Lippincott-Schwartz等人，2003; Weiss，2004）。应首先测试上述技术细节以实现特定蛋白质或不同亚细胞区室的FRAP实验的最佳条件。漂白和捕获条件可以通过在固定电池中进行FRAP来优化。我们常规地在玻璃底盘上生长细胞并使用PBS中的4％PFA在室温下固定15分钟。固定后，PFA溶液被成像介质替代，并且在该组细胞上测试FRAP方案。按照这种方法，可以在与真实实验设置匹配的条件下实现优化这些优化实验的主要目的是：
    1. 确定适合在感兴趣区域中快速有效地漂白分子的最佳条件，用于实际实验。
    2. 优化时间推移设置，用于在之前和更重要的是漂白后体系的采集。主要目的是获取图像而不导致光漂白（<〜5％）的样品在不损害FRAP分析的给定频率下
  2. 在优化步骤之后，在活细胞中进行FRAP测试。有两个重要的点需要考虑，与观察到的恢复过程的一半时间有关（Weiss，2004）。首先，如果半衰期与漂白步骤相当，则漂白分子可能在漂白步骤期间从漂白区域扩散远远低于回收率的可能性（Weiss，2004）。如果是这样，需要优化漂白方案以使该步骤更快（〜小于回收一半时间的3倍）。这可以例如通过减少想要漂白的区域的面积，或通过增加激光功率和减少漂白步骤期间的迭代次数，或通过增加在漂白期间激活的激光线的数量来实现步骤或，通过降低漂白步骤的扫描速度同时进行迭代次数也减少。用于E-钙粘蛋白和Ect2的漂白步骤所提到的条件是对表现出非常独特动力学的蛋白质进行FRAP实验的良好标准初始条件。其次，慢采集帧可能损害恢复测量。由于使用在恢复过程的前1.5个时间期间获取的信息计算FRAP曲线的半时间，因此FRAP参数的自信估计要求采集足够快以准确地采样该早期时间。为了满足这个要求，在漂洗前和漂洗后获取期间增加扫描速度或减少取样面积可以提高采集速度。选择第二个选项是为了捕获Ect2迁移率的快速动力学
  3. 在设置这些条件之后，必须考虑优化的方案不损害细胞的存活力。通常，UV照射引起毒性，这通过细胞形态学和膜起泡的变化是明显的（Frigault等人，2009）。采集FRAP采集之前和之后的相差或差分干涉对比（DIC）图像是评估细胞活力的补充测试。值得注意的是，UV照射可以引起膜损伤，其通常导致意想不到的高固定分数。为此，已经提出在相同细胞上和在相同区域上进行2个连续的FRAP实验，以确定即使在两次连续的光漂白之后恢复也发生（Lippincott-Schwartz等人>，2003）。

图像分析

钙粘蛋白营业额
使用Image J软件进行图像分析。通过应用2个像素半径的中值滤波器减少了图像上的噪声。由于在ZA的E-钙粘蛋白动力学相对缓慢（在我们的经验中，FRAP实验花费〜10分钟到平台），在图像采集期间不可避免地发生一些细胞运动和/或漂移。如果这些运动真的损害测量，则放弃实验。然而，通过使用Turbo-reg（）可以校正和/或消除那些具有轻微细胞运动的实验http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/）插件。之后，使用在漂白区域标记的ROI计算FRAP谱，并使用插件FRAP分析器获得荧光强度分布。从所有时间的荧光强度中减去漂白后立即的ROI中的荧光强度（F em（0））（ t ），然后将结果标准化为预漂白值（Eq.1，图2A）。然后将结果导入Prism软件用于统计分析。汇集来自11个重复的数据（3次独立实验），并且将漂白步骤后的时间点的荧光强度拟合为等式：
(Eq.1）
其中（t），（ - t））是分别在漂白之前和漂白后任何时间的ROI的平均荧光。 Mf 是移动部分， t _1/2是恢复的一半时间，t是以秒为单位的时间。在Prism中，通过使用非线性回归和使用Y sub = 0的指数一相关联模型来实现这种拟合，并且其中E ref对应于平稳值。然后将数据表示为平均值±SEM，并通过t检验评估统计显着性

图2.E-钙粘着蛋白-GFP和GFP-Ect2 FRAP实验的实施例，左图，使用MCF-7细胞的E-钙粘蛋白亚细胞分布的代表性图像-GFP和GFP-Ect2分别在E-钙粘蛋白和Ect2敲除背景中表达。中心，在FRAP实验期间在pre（显示）和后漂白（未显示）阶段的采集帧的细节。右，E-钙粘蛋白-GFP（上图）和GFP-Ect-2（下图）的荧光恢复曲线。注意时间刻度的差异。 B.使用单指数（Eq.1）或双指数（Eq.2）函数的GFP-Ect2恢复曲线的非线性回归的细节。这表明单指数函数不能适当地调整到实验曲线。

Ect2周转
还使用Image J软件进行图像分析。值得一提的是，Ect2 FRAP实验需要〜1分钟，因此没有观察到显着的漂移或细胞移动。为了计算FRAP谱，在漂白的GFP-Ect2区域的ROI被标记，并且在每个时间点使用图像J软件中的测量堆栈插件确定其平均荧光。如上所述处理荧光强度用于E-钙粘蛋白-GFP以获得拟合到双指数方程（图2B）的恢复曲线和数据：
（公式2）
F inf（t）是ROI的平均荧光， Mf 是移动分数， > 和 f 是快速和慢速移动组件的加权因子，和它们各自的一半时间，而 t 是以秒为单位的时间。在Prism中，这种拟合通过使用非线性回归和使用Y sub = 0的指数两相关联模型来实现，并且其中平台值对应于M f。 br /> 对于这种情况，应用获得荧光恢复= 0.5时的t值的数值解以获得Ect2恢复的总半衰期。这在Matlab（MathWorks，Australia）中进行如下。拟合的值可以引入为：

>> （括号中为实际值）
然后使用FRAPtwo函数（见下文）和下面的语句计算全局 t _{1/2 1/2} = fzero（@（t）FRAPtwo（Parameters，t），7）;
然后将数据表示为平均值±SEM，并通过t检验评估统计学显着性
以下是用于计算 t _1/2的Matlab函数的描述。

function [y] = FRAPtwo（X，t）;

高原= X（1）;
fractionfast = X（2）;
Kfast = ln（2）/X（3）;
fractionslow = X（4）;
Kslow = ln（2）/X（5）;
y =平台*分数快速*（1-exp（-Kfast * t））+平台*分数low *（1-exp（-Kslow * t）） -
结束

食谱

丁酸钠
在水中制备丁酸钠的1M储备溶液过滤灭菌
在使用前保存在4°C
己二胺溴化物（polybrene）
聚凝胺的储备溶液通过将其稀释到水中至最终储存浓度为8mg/ml 通过0.2μm过滤器过滤灭菌
映像媒体
Hank's平衡盐溶液，补充有10mM HEPES pH7.4 5mM CaCl 2
4％多聚甲醛的PBS溶液
通过稀释储备溶液（16％甲醛）制备用HCl或NaOH调节pH至7，如有必要，使用pH指示剂
等分试样稀释并储存在-20°C

致谢

这项工作是由儿童癌症项目的肿瘤学儿童基金会，昆士兰大学早期职业资助（2012003354）支持GAG。 RP由UQI（UQ国际）博士支持。奖学金和澳新银行受托人博士医学研究奖学金。在澳大利亚癌症研究基金会的慷ous支持下建立的ACRF/IMB癌症生物学成像中心进行共聚焦显微镜检查。

参考文献

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