材料和试剂

病毒感染的植物组织
TRIzol试剂（Invitrogen）
氯仿（Sigma-Aldrich）
异丙醇（Sigma-Aldrich）
乙醇（EtOH）
焦碳酸二乙酯（DEPC）（Sigma-Aldrich）
Hybond NX Neutral Membrane（Amersham biosciences，目录号：RPN203T）
40％丙烯酰胺/N'N'-双 - 亚甲基 - 丙烯酰胺（19：1）（Life Technologies，Ambion ）
四甲基乙二胺（EDTA）（Sigma-Aldrich）
脲（Sigma-Aldrich）
Hyperfilm TM MP（Amersham biosciences，目录号：28-9068-45）
溴化乙锭（Sigma-Aldrich）
乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）（Sigma-Aldrich，目录号：39391）
过硫酸铵（APS）
四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma-Aldrich）
Tris碱（AMRESCO）
硼酸（Fisher Scientific）
甲酰胺（Sigma-Aldrich）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich）
二甲苯蓝（Sigma-Aldrich）
3 MM Whatman过滤纸
1-甲基咪唑（Sigma-Aldrich）
盐酸（HCl）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Fisher Scientific）
20x盐水柠檬酸钠（SSC）缓冲液（Sigma-Aldrich）
ULTRAhyb-Oligo缓冲液（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM8669）
Megaprime DNA标记系统（通用电气公司，型号：RPN1604）
液氮
无RNase水
小凝胶（规则蛋白凝胶的尺寸为1.5mm厚）（Bio-Rad，Mini-Protean Cell）
中性Hybond硝酸纤维素膜
RNase ZAP（Life Technologies，目录号：AM9784）
DEPC处理的水（见配方）
10x Tris-硼酸盐-EDTA（TBE）缓冲液（参见配方）
10％APS（参见配方）
15％聚丙烯酰胺凝胶（见配方）
2x加载缓冲液（见配方）

设备

杵和臼
半干电吸印机（Bio-Rad）
Protean II垂直凝胶系统（Bio-Rad）
Nanodrop分光光度计
离心机
杂交炉
UV透射仪
微量离心管
电泳仪
X光片

程序

RNA分离
1. 使用研钵和研杵在液氮中研磨50-100mg病毒感染的植物组织。立即加入1ml TRIzol试剂，继续研磨直到形成均匀的糊状物。吸取均质材料到无菌微量离心管中，在25-30°C孵育5分钟，以允许核蛋白复合物完全解离。
2. 加入200μl氯仿/ml TRIzol试剂，用于样品组织匀浆。用手转动微量离心管数次，摇动样品，在20-30℃下孵育2-3分钟。
3. 在室温（20-25℃）下将样品以不超过12,000×g离心15分钟。
4. 离心后，混合物在低级红色酚 - 氯仿相，中间相和无色上层水相中分离。
5. 在不干扰中间相的情况下，小心地移出水相并将其转移到新的无菌微量离心管中。
6. 通过每ml所用的TRIzol试剂加入0.5ml异丙醇从水相中沉淀RNA
7. 孵育样品在20-30°C 10分钟。通过在2-8℃下以不超过12,000×g离心样品10分钟来回收总RNA。 RNA将在微量离心管的底部和侧面形成凝胶状沉淀
8. 不干扰沉淀去除上清液。通过在管的侧面缓慢加入1ml的75％乙醇洗涤RNA沉淀
9. 通过涡旋混合样品，并在2-8℃下以不超过7,500×g离心5分钟。
10. 小心弃去上清液，不影响沉淀。真空或空气干燥沉淀10-15分钟，并重悬在50μl无RNase的水（市售或DEPC处理的无菌水）。体积是可调节的，但是较高浓度是优选的，因为这将允许较低体积加载到凝胶上。不要过度干燥颗粒，否则将难以溶解。通过使用分光光度计（例如，Nanodrop）测量260nm处的吸光度来定量RNA的浓度，并储存在-20℃直至准备使用。 RNA将在这些条件下稳定数月
15％聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
小凝胶（规则蛋白凝胶的尺寸为1.5mm厚）良好以检测小RNA的表达。然而，为了分析单个小RNA的长度变体（例如20nt，21nt，22nt），需要运行更长的凝胶。在组装电泳系统之前，使用RNase ZAP彻底清洁所有设备以进行任何RNase污染。通过使用无菌溶液和不含RNase的塑料制品避免整个程序中的核酸酶污染
1. 根据制造商的说明和handcast 15％聚丙烯酰胺凝胶装配凝胶铸造室。让凝胶在室温（20-25℃）下聚合至少30分钟至1小时。根据制造商的建议设置电泳模块。使用注射器用流动缓冲液（0.5×TBE）彻底冲洗孔以除去任何痕量的尿素，并在装载样品之前用跟踪染料预运行凝胶约15分钟。
2. 在预运行凝胶时，制备RNA样品。理想情况下，为了良好的siRNA分辨率，建议加载35-40μg总RNA（基于RNA的纯度和浓度）。因此，使用DEPC处理的水调节待装载的每个样品（根据最小浓缩的样品）的体积。向样品中加入等体积的2x负载染料。通过轻轻敲击轻轻混匀，然后短暂离心
3. 盖上管并通过在90-100℃加热15分钟使RNA样品变性。简单地旋转样品，然后在冰上快速冷却5分钟
4. 加载样品和siRNA大小标记，并在200V运行凝胶约一小时。
  注意：凝胶的电压和持续时间取决于所使用的电源和凝胶电泳系统的类型。当溴酚蓝染料迁移到凝胶的末端时停止运行。不要超过。
半干电印迹到尼龙膜上的siRNA
1. 小心拆卸电泳仪器，不要破坏凝胶。切割含有跟踪染料（二甲苯蓝和溴酚蓝）条带的凝胶的下部。在15％聚丙烯酰胺凝胶上，溴酚蓝染料前面运行接近10nt的长RNA。包含tRNA和5S RNA的凝胶的上部用溴化乙锭溶液（0.25μg/ml溴化乙锭在0.5x TBE缓冲液中）染色10-20分钟。使用360 nm紫外透射仪检查凝胶中RNA的完整性和等量加载。 tRNA条带的清晰度和清晰度是RNA质量和完整性的良好指标（图1）
  
  图1.显示23个核苷酸的小干扰RNA分子的Northern印迹（上图）。在RNA转移前，溴化乙锭染色的rRNA在凝胶中作为加样对照（下图）。
2. 为了制备转移夹心，将3MM Whatman滤纸（六片）和中性Hybond硝酸纤维素膜切成凝胶大小。将膜和Whatman纸浸泡在0.5x TBE缓冲液中，直到它们完全润湿。膜的完全润湿对于确保核酸的适当结合是重要的。组装三明治如下。
3. 将三块Whatman纸放在电印机的阳极板上。确保滚出可能抑制转印的气泡。
4. 将膜转移到滤纸的顶部并且滚出在膜和滤纸之间形成的任何气泡。电泳后，将凝胶在转移缓冲液（0.5x TBE）中平衡5至10分钟。平衡有助于去除电泳缓冲盐和去污剂。小心地将平衡的凝胶放在膜上，使叠层尽可能完美
5. 将在运行缓冲液中饱和的剩余三块Whatman纸放在纸叠上，并滚出任何残留的空气
6. 用转移缓冲液（0.5×TBE）稍微润湿该叠层，并将阳极板放在顶部，而不干扰凝胶 - 硝化纤维素叠层并牢固地固定。
  注意：重要的是在设置转印时，排除滤纸和隔膜中夹带的多余缓冲液和气泡。
7. 设置电源并在10 V和200 mAmp（恒定电流设置）下运行传输单元30分钟。小心地拆卸传输单元，取出滤纸和凝胶在尼龙膜的顶部。在RNA转移侧用铅笔标记膜上的凝胶槽的取向。
化学交联
RNA与膜的交联经常提高Northern印迹的灵敏度。可使用常规方法例如暴露于标准剂量的UV（120mJ/cm 2）或通过在烘箱中烘烤（80℃下30分钟）将RNA固定到膜上。这两种方法都可以成功使用，但是使用基于EDC的小RNA对膜的交联通过杂交大大提高了小RNA的信号分辨率（Pall和Hamilton，2008）。
1. 在即将使用前，制备0.16M EDC溶液在0.13M 1-甲基咪唑中的溶液，并用HCl调节溶液的pH至8。
2. 切割一张3MM的Whatman滤纸，比膜的尺寸略大，并用EDC溶液使其饱和。
3. 将膜置于EDC饱和的3MM纸上，RNA的面向上转移到侧面。推出夹在膜和滤纸之间的任何气泡
4. 盖上托盘，用膜包裹膜和滤纸，并在60℃下孵育1至2小时。
5. 取出膜，用无RNA酶的水冲洗，以除去任何残留的EDC溶液
6. 可以在去除残留的EDC之后将膜干燥并储存在-20℃下，而不损害siRNA检测的灵敏度，或立即用于杂交。
杂交
最后，将具有固定RNA的膜与特异性放射性标记的探针一起温育。为此，遵循一般的预杂交和杂交程序
1. 使用ULTRAhyb-Oligo缓冲液在42℃下轻轻搅拌30分钟至1小时进行预杂交。
  注意：对于小RNA获得的探针信号强度可以根据所使用的杂交缓冲液的组成而变化。
2. 带有^{P的末端标记探针;许多试剂盒可商购获得，但我们使用Megaprime DNA标记系统并遵循制造商的说明书。将膜与制备的32 P端标记的寡核苷酸探针杂交。探针必须以高比活性（≥10⁸ cpm /μg模板）标记。}
3. 杂交膜过夜（14-16小时），在38至42℃，轻轻搅拌。
4. 杂交后，将膜用低严格性缓冲溶液（2×SSC，0.5％SDS）洗涤两次，每次10分钟，并在42℃下使用高严格性缓冲液（0.1×SSC，0.1％SDS）洗涤5分钟。如果需要，可以在更严格的条件下（例如，当观察到高背景水平时）增加洗涤时间。
5. 将膜暴露于-80°C的X射线胶片，用于信号可视化。根据信号强度调整曝光时间。
  注意：所有涉及放射性物质的步骤都必须遵循适当的安全准则，这一点非常重要。

食谱

DEPC处理水
在连续搅拌和高压釜下将1ml DEPC溶解在1L蒸馏水中
10x TBE（1升）
108克Tris碱
55克硼酸
40ml EDTA（0.5M，pH8.0）用DEPC处理的水使体积达到1升，通过搅拌和高压釜混合
10％APS
混合1克APS在10毫升无RNA酶的水和过滤灭菌
15％聚丙烯酰胺凝胶 21克尿素
5 ml 10x TBE
18.8ml 40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19:1）用无RNA酶的水将体积加至50ml，涡旋，直到尿素溶解当准备好倾注凝胶时，通过短暂旋转
250μl10％过硫酸铵
50μlTEMED
注意：TEMED应该最后添加。混合溶液，立即倒入凝胶，不产生任何气泡，让它聚合。这个配方足以填充四个迷你凝胶盒。量可以根据应用调整。凝胶可以紧紧包裹在saran包装中，然后插入梳子储存在4℃冰箱中。不要冻结凝胶。
2x加样缓冲液（50ml）
47.5ml 95％甲酰胺 2ml EDTA（20mM，pH8.0） 0.025g溴酚蓝
0.025克二甲苯蓝

致谢

该方案改编自Pall和Hamilton（2008）描述的方案。我们非常感谢Melanie Walker女士和HélèneSanfaҫon博士的讨论和技术咨询。

参考文献

Pall，G.S。和Hamilton，A.J。（2008）。改进的Northern印迹方法，用于增强小RNA的检测。 Nat Protoc 3（6）：1077-1084。
Panwar，V.，McCallum，B。和Bakkeren，G。（2013a）。小麦叶锈病真菌宿主诱导的基因沉默小麦叶锈病病原性基因 81 81（6）：595-608。
Panwar，V.，McCallum，B。和Bakkeren，G。（2013b）。通过致病性基因的内源性沉默
植物表达序列导致抑制小麦锈病。 73 73：521-532。