材料和试剂

植物组织
液氮
MES
苯甲基磺酰氟（PMSF）
EDTA
聚乙烯吡咯烷酮（PVP）
二硫苏糖醇（DTT）
CaCl <2>
葡萄糖
牛血清白蛋白（BSA）
Na ₂ 3
酒石酸钾
CuSO 4 ^。 5H sub 2 O
KOH
NaOH
Folin& Ciocalteu的酚试剂（Sigma-Aldrich，目录号：47641）
海藻糖（Sigma-Aldrich，目录号：T9531）
葡萄糖，GOD-PAP（DIALAB GmbH，目录号：D95218B）
提取缓冲液（参见配方）
透析缓冲液（参见配方）
海藻糖缓冲液（见配方）
葡萄糖标准（见配方）
BSA标准（参见配方）
Lowry缓冲区（参见配方）

设备

砂浆和杵
Spectra/Por ^{^®} 1 透析膜（IEEE，目录号：132660）
注意：96孔透析系统可用于透析多个样品。
具有平底的透明96孔板
摇杆
冷藏微量离心机
预冷微量离心管
100ml气瓶
磁力搅拌板和磁铁
冷室
分光光度读数仪

程序

蛋白质提取
注意：除非另有说明，否则始终在冰上工作。
1. 研磨植物组织在液氮中用研钵和杵。
2. 在冷冻的微量离心管中等分100毫克组织粉末。每个样品至少准备3次重复。
3. 向每个样品中加入1ml冰冷的提取缓冲液。通过上下吹吸使样品均匀。以18,000×g离心，4℃，10分钟。
4. 转移上清液到一个新的，冷冻的微量离心管。所得蛋白质提取物可在-80℃保存
透析
1. 用水冲洗一片Spectra/Por透析膜，在底部打结（图1）。
2. 将500μl的蛋白质提取物转移到管中，并在顶部打结（图1）。
  
  图1.在透析膜底部和顶部打一个结
3. 将管放置在装有冰冷的透析缓冲液的100ml圆筒中。在磁力搅拌板上连续搅拌下，将提取物在4℃透析2-3小时
4. 更换透析缓冲液，并在4℃下继续透析过夜。
5. 将透析的提取物转移到新的冷冻微量离心管中。透析的提取物可以储存在-80℃
海藻糖酶活性适用于96孔板
注意：除非另有说明，否则始终在冰上工作。
1. 准备95℃的水浴。

对于样品

转移10微升透析产品在96孔板平底（=板S）。
将10微升各葡萄糖标准品转移至平板S.

对于空白

转移10微升透析产品在96孔板平底（=板B）。
将板B在95℃的温度下放置5分钟以使存在于空白中的海藻糖酶变性
将板B在冰上放置2分钟。

对于样品和空白

向板S和B中加入50μl海藻糖缓冲液。通过上下吹吸混匀
孵育板S和B在30℃摇床上30分钟。
通过在95℃下煮沸5分钟（海藻糖酶的变性）停止反应
将板S和B放在冰上2分钟
添加200微升葡萄糖，GOD-PAP到板S和B，用于通过比色法测定样品和空白的葡萄糖浓度。通过上下吹吸混合。
孵育板S和B在30°C在摇床上15分钟。
用分光光度读数板（30℃）测量板S和B在505nm处的吸光度
确定葡萄糖标准曲线以计算样品和空白中存在的葡萄糖浓度（nmol）。从样品中减去空白的葡萄糖浓度（参见实施例：计算excel中的海藻糖酶活性）。

对于蛋白质（Lowry过程，Van Houtte等人，2013 ）

转移10微升的透析产品在平底96孔板（=板P），并加入30微升水到这些样品。
将40μl各自的BSA标准品转移至平板P.
加入200μl的试剂C（Lowry缓冲液）到板P，并在室温下孵育10分钟。
加入20μl试剂D（Lowry缓冲液）到板P，并在30°C孵育30分钟。
用分光光度板读数器（30℃）测量板P在546nm的吸光度
使用BSA标准曲线来确定提取物中存在的蛋白质（μg）的量（参见实施例：计算excel中的海藻糖酶活性）。
表示海藻糖酶比活性为每分钟每mg蛋白质释放的葡萄糖的nmol（参见实施例：计算excel中的海藻糖酶活性）。

数据分析

在这里我们显示如何计算来自拟南芥 Col-0幼苗的蛋白质提取物的海藻糖酶活性的实例。

葡萄糖标准曲线
使用excel，绘制各个葡萄糖标准品的葡萄糖浓度在X轴上和相应的吸光度（505nm）在Y轴上（表1;图2）。将线性趋势线添加到葡萄糖标准曲线和显示其方程（图2; [1]）。

[1] y = 0.0157x + 0.0858

表1.在505nm（板S和B）的吸光度

葡萄糖标准	吸光度（505nm）
0nmol葡萄糖	0.08
20 nmol葡萄糖	0.3721
40nmol葡萄糖	0.7421
60 nmol葡萄糖	1.0355
80 nmol葡萄糖	1.3792
100nmol葡萄糖	1.6143
拟南芥 Col-0组织	吸光度（505nm）
样品	0.1483
空白	0.0898

图2.葡萄糖标准曲线

葡萄糖浓度的测定
可以使用方程式[1]和样品和空白的吸光度（505nm）（表1）来计算样品和空白中存在的葡萄糖浓度。

[2]样品中的Nmol葡萄糖 =（0.1483-0.0858）/0.0157

= 3.9809

[3] Nmol葡萄糖在空白 =（0.0898-0.0858）/0.0157

= 0.2548

为了知道提取物中每分钟释放多少葡萄糖，从[2]中减去[3]，并除以孵育时间（min）的持续时间。

[4]每分钟释放的Nmol葡萄糖 =（3.9809-0.2548）/30

= 0.1242
BSA标准曲线
由于海藻糖酶活性是每单位蛋白质表达的，我们需要确定提取物中存在的蛋白质的量。使用excel，在X轴上绘制相应BSA标准物的蛋白质含量，在Y轴上绘制相应的吸光度（546nm）（表2;图3）。将线性趋势线添加到BSA标准曲线，并显示其方程（图3; [5]）

图3. BSA标准曲线

[5] y = 0.0242x + 0.0576

蛋白质含量的测定
方程[5]和蛋白质提取物的吸光度（546nm）（表2）可用于计算蛋白质含量。

表2.在546nm（板P）的吸光度

BSA标准	吸光度（546 nm）
0μg蛋白质	0.0488
10μg蛋白质	0.3224
20μg蛋白质	0.5603
30μg蛋白质	0.7159
40μg蛋白质	1.0637
拟南芥 Col-0组织	吸光度（505nm）
蛋白	0.4786

[6]提取物中的蛋白质	=（0.4786-0.0576）/0.0242
	= 17.3967

拟南芥 Col-0幼苗的海藻酸酶比活性
由于特异性海藻糖酶活性表示为每分钟每mg蛋白质产生的nmol葡萄糖，我们需要将[4]除以[6]，并乘以1,000。

[7]海藻糖酶比活性，以nmol葡萄糖/分钟/mg蛋白质计 = 0.1242/17.3967 * 1000

= 7.1393

食谱

提取缓冲区
0.1M MES-KOH，pH 6
1mM PMSF
1mM EDTA
1％（w/v）PVP
1 mM DTT
储存在4°C
透析缓冲液
10mM MES-KOH，pH 7
50μMCaCl 2
储存在4°C
海藻糖缓冲液
250mM海藻糖 62.5mM MES-KOH，pH7
125μMCaCl 2
储存在4°C
葡萄糖标准
使用10，8，6，4，2和0μl的10 mM葡萄糖溶液制备标准品，总V为10μl
新鲜配制或存储10微升等分试样在-20°C
BSA标准
使用40，30，20，10和0μl的1 mg/ml BSA溶液制备标准品，总体积为40μl
新鲜准备，保持冰上
洛瑞缓冲区
试剂A：
在0.1M NaOH中的2％（w/v）Na 2 CO 3，0.02％（w/v）酒石酸钾Na / 在室温下贮存
试剂B：
1％（w/v）CuSO 4 sub。 5H O 在室温下贮存
试剂C：
混合溶液A和B（100：1，[v/v]）新鲜准备
试剂D：
Mix Folin& Ciocalteu的酚试剂与MilliQ水（1:2，[v/v]）
新鲜准备

致谢

该协议在以下论文的框架中开发：Van Houtte等人（2013）。它是基于两个以前的出版物开发的：Brodmann等人（2002）和Pernambuco等人（1996）。 Hilde Van Houtte由KU Leuven工业研究基金（IOF/KP/08/001）提供支持。这项工作得到了FWO（G.0859.10）的资助。

参考文献

Brodmann，A.，Schuller，A.，Ludwig-Muller，J.，Aeschbacher，R.A.，Wiemken，A.，Boller，T.and Wingler，A。（2002）。在用产生海藻糖的病原体感染的拟南芥植物中诱导海藻糖酶< em> Plasmodiophora brassicae 。 Mol Plant Microbe Interact 15（7）：693-700。
Lowry，O.H.，Rosebrough，N.J.，Farr，A.L.and Randall，R.J。（1951）。使用Folin酚试剂进行蛋白质测量。 J Biol Chem 193（1）：265-275。
Pernambuco，M.B.，Winderickx，J.，Crauwels，M.，Griffioen，G.，Mager，W.H.and Thevelein，J.M。（1996）。酿酒酵母中葡萄糖触发的信号：：糖磷酸化的不同要求在葡萄糖上生长的细胞和在不可发酵的碳源上生长的细胞。 142（7）：1775-1782。
Van Houtte，H.，Vandesteene，L.，Lopez-Galvis，L.，Lemmens，L.，Kissel，E.，Carpentier，S.，Feil，R.，Avonce，N.，Beeckman， JE和Van Dijck，P。（2013）。海藻糖酶基因AtTRE1的过度表达导致增加的干旱胁迫耐受性< em> Arabidopsis 并参与脱落酸诱导的气孔关闭。植物生理学 161（3）：1158-1171。