材料和试剂

无菌塑料袋，30g容量（〜30ml）（Whirl-Pak Write-On Bags）（Nasco，目录号：B01067WA）
70％乙醇（Merck KgaA，Emsure ，目录号：1009834000）
乳胶检查手套（Dermagrip ^®，目录号：D1402-14）
无热原型1级脱脂水（Milli-Q Direct 8和16超纯水系统）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（Gibco，目录号：21300-058）
Tween 20（Sigma-Aldrich，目录号：P5927）
胰蛋白胨大豆琼脂（Oxoid Limited，目录号：CM0131）（参见Recipes）或根据培养菌需求的其它培养基。
PBS 0.1％Tween 20（参见配方）

设备

24孔板，低结合细胞（Sigma-Aldrich，目录号：Z721077）
烧杯（100 ml）
玻璃酒精燃烧器（WHEATON，目录号：WHE-237070）
用于小鼠的外科器械（小鼠外科手术试剂盒）（Kent Scientific，型号：INSMOUSEKIT）
Drigalski刮刀（Thermo Fisher Scientific，目录号：NC0242405）
微量移液器（10-100μl和100-1000μl）
微量吸头（100μl和1 ml）
1.5ml eppendorf管（Eppendorf，目录号：022363204）
结核菌素塑料注射器（1ml），具有25-27g针头规格
塑料培养皿（90×15mm）
一次性医用塑料手套（Lab Depot，目录号：266-P）
小锋利剪刀和镊子
水净化系统（Milli-Q Direct 8和16超纯水系统）（EMD Millipore，型号：ZR0Q00800）
细菌孵育器（Thermo Fisher Scientific，型号：310）
高压灭菌器（Yamato Scientific，型号：SQ-500C）
分析天平电子数字（±0.0001 g）
层流柜（Esco Global，Labculture Class II，Type A2，型号：LA2-3A2）

程序

脾提取
1. 在整个手术过程中应使用乳胶检查手套。
2. 使用推荐的细菌剂量（例如 10 ²）通过相应的通道（例如腹膜内，静脉内，皮下）感染小鼠（注1） 10 ^3，<10>），这取决于所使用的细菌的测定和毒力。用结核菌素1cc注射器，25-27g针和最大体积20ml/kg进行腹膜内感染。
  http://www.procedureswithcare.org.uk/intraperitoneal-injection-in - 老鼠
3. 重量无菌塑料旋转袋（每个小鼠脾脏一个）到mg水平。
4. 在处死后必须立即获得脾（注2）。在相应的感染期（例如，3-15天）后，通过颈部伸长来杀死小鼠，保持适当的伦理方案和规定（例如颈椎脱臼，CO ）（Nagy等人。，2006）（注3）。
5. 杀死后，用70％酒精彻底喷洒小鼠，并置于清洁或无菌表面上，在安全垂直层流罩内。
6. 用小的锋利的剪刀做一个小切口到皮肤下面的腹部底部。然后打开整个腹腔，切开腹膜，暴露脾脏（位于小鼠的左上腹部）或所需的器官，按照推荐的尸检方案（Covelli，2013 http://eulep.pdn.cam.ac.uk/Necropsy_of_the_Mouse/printable.php ）（注4）（图1）。
  
  图1.脾提取指示：A.用于尸体剖检的小鼠的位置，B.小鼠皮肤的开口，C.腹壁的开口和D.脾的提取（用白色箭头指出）。 2013年Covelli拍摄的照片。有关详情，请参阅： http://eulep.pdn.cam.ac.uk/Necropsy_of_the_Mouse/printable.php （咨询日期：09/30/2013）。

脾匀浆

加入9份含有0.1％Tween 20/g脾的PBS（稀释度1:10），假设1g脾脏的体积对应于1ml PBS（例如0.5g脾脏， 4.5ml PBS 0.1％Tween 20）。
注意：如果在均质化过程开始时使用小体积，然后剩余体积完成到1:10稀释，均质化就会更容易。
通过用手挤压袋中的器官来精确地进行脾匀浆。
注意：为了释放细胞内细菌，通过在含有0.1％吐温20的PBS中挤压脾组织破坏脾细胞。
样品均化后，根据预期的细菌脾定植，用1×PBS（在1.5ml eppendorf管或24孔板上）进行十倍（或所需）稀释。
注意：小心且广泛地打开塑料袋（使用钢丝）以避免移液管污染。对于使用1×10 6 CFU的细菌的感染，范围为1-30天，平板10 -10 ⁵ em>稀释。

电镀

建议使用两种电镀方法：
方法A
每个样品使用两个板（图2A），在胰蛋白胨大豆琼脂（或用于生长测试细菌的推荐培养基）板上分配三个单独的20μl的每种稀释液。然后，在孵育（5-10分钟）之前，让液滴被吸收在琼脂表面（不扩散液滴）。
方法B
在每个琼脂板中分配一个100微升，并用无菌Drigalski刮刀分配样品，直到接种物完全分散在琼脂表面上，每个样品使用两个板（图2B）。
注意：
1. 方法A更快，并且需要更少的琼脂板，因为四个稀释液可以定位在每个板上。此外，每次稀释最多可以投放三滴，减少计数错误。如果接种101稀释液，可以检测到每克脾脏至少500个细菌。
2. 方法B较慢并且增加了板消耗，但是当预期低细菌负荷时更加敏感。菌落计数更容易，因为每个稀释使用整个平板。如果涂覆10 ¹稀释，则可检测到每g脾脏至少100个细菌。
将板在细菌菌株（例如37℃，在5％CO 2气氛下）的所需条件下培养2-3天，直到菌落形成单位（CFU）为显然。
计数各种稀释液中的CFU。只使用获得单独集落的板（和相应的稀释度）（图2A中为10-30个CFU或图2B中为30-300个CFU）。
通过将CFU乘以相应的稀释度计算脾细菌负荷，并分别通过方法A中的50或方法B中的10。
CFU方法可以通过CFU /脾脏（回收的总CFU）或者通过CFU /脾脏脾脏（回收的总CFU除以脾脏的总克数）来计算。虽然第一种方法没有考虑脾脏炎症（大小），但第二种方法校正脾肿胀。在任一情况下，总是建议在单独的图中绘制脾脏重量。

图2.样品电镀方法

笔记

优选地，雌性小鼠（来自不同窝的雄性小鼠具有战斗的倾向），重量范围在18-22克。体重/年龄比取决于小鼠的品系。老年小鼠具有显示更多重量变化的倾向。应避免重量或年龄的差异。建议与四个小鼠的组一起工作。小鼠应在实验前处于良好的健康状况。在使用免疫抑制小鼠的情况下，推荐包括一组未感染的阴性对照小鼠以检查先前获得的细菌或酵母菌感染。
由于在组织衰变过程中微生物污染，不推荐在自然死亡或长时间后的器官中的细菌计数。
用于处死的其它方法是用诸如异氟烷（吸入> 15％）或异丙酚（静脉内> 50mg/kg）的组分的CO 2附加或过量麻醉。
避免鼠标的皮肤毛发与腹膜腔接触。
脾脏容易分离，没有大量的出血。手术器械必须用酒精消毒并在脾脏操作之前进行发炎以避免污染。外脏脂肪应从脾脏中清除，以避免额外的体重错误。

食谱

胰蛋白胨大豆琼脂
将40克培养基悬浮在1升无热原型1级脱脂水中加热频繁搅拌煮沸1分钟，使介质完全溶解
121℃高压灭菌15分钟
PBS 0.1％Tween 20
将以下物质溶解在800ml无热原型1+级脱盐水H sub 2 O中
8克NaCl
0.2克KCl
1.44g的Na 2 HPO 4
0.24g的KH 2 PO 4 sub/
1ml吐温20 将pH调节至7.4
使用额外的无热原型1+级脱盐水H sub 2 O调节体积至1 L
高压灭菌
灭菌

致谢

我们感谢María-JesúsGrilló帮助这种技术的标准化。该方案改编自Barquero-Calvo等人（2007）和Nagy等人（2007）和Covelli（2013）的原始发表的论文。这项工作由FIDA-2006，FS-CONARE（UNA/UCR），MICIT/CONICIT（FI-487-09），8-N-2005和B/3456-1（NeTropica），B/3456- 2（IFS），AGL2004-01162/GAN（西班牙），CNRS和INSERM（法国）和MASTERSWITCH项目（欧洲共同体）。

参考文献

Barquero-Calvo，E.，Chaves-Olarte，E.，Weiss，D.S.，Guzman-Verri，C.，Chacon-Diaz，C.，Rucavado，A.，Moriyon，I.and Moreno，E。 Brucella abortus 使用隐形策略来避免先天免疫系统的激活在感染发作期间。 PLoS One 2（7）：e631

Covelli，V.（2013）。鼠标尸检指南。
http://eulep.pdn.cam.ac.uk/Necropsy_of_the_Mouse/printable.php

Nagy，A.，Gertsenstein，M.，Vintersten，K。和Behringer，R。（2006）。通过颈椎脱位快速和人道地牺牲小鼠。 CSH Protoc 2006（1）。