材料和试剂

MDCK单元格
请注意，在美国典型培养物保藏中心（ATCC）上有多种MDCK变体。此协议已针对MDCK（CCL-34），MDCK.1（CRL-2935）和MDCK.2（CRL-2936）进行测试
由12个质粒反向遗传系统产生的重组A/California/04/2009病毒（来自美国纽约罗切斯特大学的Toru Takimoto教授的慷慨礼物）（Bussey等人，2010）
胰蛋白酶/EDTA（Mediatech，Cellgro ，目录号：25-053-CI）
SeaPlaque Agarose（Lonza，目录号：50100）
TPCK-胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：20233）
没有Ca 2+和Mg 2+的PBS（Mediatech，Cellgro ，目录号：21-030-CV）的
具有Ca 2+和Mg 2+的缓冲液（Mediatech，Cellgro ，目录号：21-040-CV）的
10％福尔马林（Sigma-Aldrich，目录号：HT501128-4L）
TritonX-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284）
5％山羊血清的DPBS（Gibco，目录号：16210-072）中
来自杂交瘤H16-L10-4R5（ATCC，目录号：HB-65）的小鼠抗NP抗体
碱性磷酸酶缀合的驴抗小鼠抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：715-056-150）
Alexa Fluor 488共轭的山羊抗小鼠抗体（Invitrogen，目录号：A11001）
BCIP/NBT底物（Vector Laboratories，目录号：SK-5400）
DMEM（Mediatech，Cellgro ，目录号：10-017-CV）
DMEM粉末（Mediatech，Cellgro ，目录号：50-003-PB）
热灭活的胎牛血清（Mediatech，Cellgro ，目录号：26140079）
HEPES（Mediatech，Cellgro ，目录号：25-060-CI）
青霉素/链霉素（Mediatech，Cellgro ，30-002-CI）
7.5％BSA Fraction V（Gibco，目录号：15260）
RPMI 1640粉末（Mediatech，Cellgro ，目录号：50-020-PB）
Tris碱（US Biological，目录号：T8600）
氯化钠（NaCl）
氯化镁（MgCl 2）
氢氧化钠（NaOH）
完成DMEM（cDMEM）（参见配方）
2x DMEM（参见配方）
RPMI（见配方）
0.5％Triton X-100（参见配方）
碱性磷酸酶（AP）反应缓冲液（参见配方）

设备

标准组织培养设备
12孔组织培养板
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
倒置荧光显微镜（可选）
摇杆
实验室铲
加热搅拌板
涡流
Axiovert 200显微镜

软件

IPlab3.6.5软件

程序

第1天

在12孔板上的每个孔中接种悬浮在1ml cDMEM中的5×10 5个MDCK细胞。
将板在5％CO 2培养箱中在37℃温育过夜

第2天（或直到细胞达到95％-100％汇合）

病毒在RPMI中连续稀释（10倍），涡旋每个稀释物并在使用前保持在冰上。
将MDCK细胞用1ml DPBS漂洗两次
MDCK细胞用500μl从步骤3制备的病毒接种
将板在5％CO 2培养箱中在37℃下孵育45分钟
准备SeaPlaque DMEM（pDMEM）
1. 将2×DMEM在37℃水浴中温热，并在搅拌下在约45-50℃的热板上将2％SeqPlaque琼脂糖熔化（*帽应稍微释放以防止压力累积）。
2. 为了获得pDMEM，将预温热的2×DMEM和2％琼脂糖在无菌容器中以1:1的比例混合，并在室温下放置5-10分钟以冷却。
3. 向pDMEM中加入TPCK-胰蛋白酶（终浓度：1μg/ml）
抽吸病毒接种物，并用1ml DPBS冲洗MDCK细胞一次。
向每个孔中加入1.5ml来自步骤7-c的pDMEM + TPCK-胰蛋白酶
将板在室温（RT）下放置10-15分钟，直到pDMEM固化
将板在37℃，5％CO 2下以反向取向（底部的盖子）温育3天。

第5天（或直到斑块的可视化）

通过将1.5ml 10％福尔马林直接添加到琼脂糖顶部来固定MDCK细胞，并在RT下温育2小时。
吸出额外的福尔马林，并且使用实验室刮刀或等效工具，从孔中移除并且小心地丢弃琼脂糖而不干扰单层细胞。
注意：在此步骤后，可以通过添加PBS覆盖细胞并在4°C下保存，以停止实验。
MDCK细胞通过300μl0.5％Triton-X100在DPBS中在搅拌下在台上透化5分钟。
将细胞用1ml PBS漂洗两次
在室温下用摇动器摇动，用300μl5％的山羊血清在DPBS中封闭细胞30分钟
将细胞与H16-L10-4R5抗体（1:40）一起在300μl5％的山羊血清中在室温下摇动摇动培养1小时。
将细胞用1ml PBS漂洗两次
将细胞与碱性磷酸酶缀合的驴抗小鼠（1：1,000）在300μl5％山羊血清中在室温下在摇动器上摇动下孵育45分钟。
用1ml PBS冲洗细胞两次，用AP反应缓冲液冲洗细胞一次
准备BCIP/NBT溶液。
1. 向每5ml的AP反应缓冲液中加入2滴溶液A，B和C
2. 通过倒置管4-6次混合
向每个孔中加入300μlBCIP/NBT溶液。将板放在摇摆器上在黑暗中30分钟或直到颜色的发展。
通过用ddH 2 O漂洗该板来终止反应。
将板在室温下风干。
计数斑块数，检查斑块形态并测量斑块的大小
荧光，荧光聚焦测定（FFA）的替代可视化方法
（从步骤18开始继续）
- 19.1
- 将细胞与山羊抗小鼠Alexa Fluor 488抗体一起温育（1:1,000）在300μl的5％山羊血清中在室温下暗处培养45分钟。
20.1用1ml PBS冲洗细胞两次。
21.1细胞用500μlDPBS覆盖并在4℃下保存
- 22.1
- 检查斑块形态，并使用倒置荧光显微镜测量斑块的大小（图1）注意：该协议已针对流感病毒进行了优化。修改可能需要用于其他病毒。例如，要求的因素对于多轮的病毒复制应该加入 pDMEM。
  
  图1. A /加利福尼亚/04/2009/H1N1重组病毒（rCA0409）的个体斑块的直径。 A.两个100个单个斑块的直径（μm）不同的CA0409病毒，野生型（WT）和HA-S328Y突变体（HA328Y）。通过Axiovert 200显微镜使用5x物镜和通过IPlab3.6.5软件测量每个斑块的直径。统计通过单尾学生t检验进行。 B.代表性形象用Alexa Fluor 488染色的CA0409病毒噬菌斑，比例尺= 200 μm。图像由Sensicam使用IPlab 3.6.5（数据未公布）（Tse等人，2013）。

食谱

cDMEM（在0.2μm过滤单元中过滤）

DMEM	432.5毫升
热灭活的胎牛血清	50 ml
1 H HEPES	12.5 ml
青霉素/链霉素	5 ml

2x DMEM（在0.2μm过滤单元中过滤）

DMEM粉末
13.48克

7.5％BSA馏分V
26.7毫升

1 M HEPES
12.5 ml

青霉素/链霉素
5 ml

ddH 2 2至500ml
RPMI（以0.2μm过滤单位过滤）

RPMI 1640粉末
5.2克

7.5％BSA馏分V / 13.3毫升

1 M HEPES
12.5 ml

青霉素/链霉素
5 ml

ddH 2 2至500ml
0.5％Triton X-100

Triton X- 100
1 ml

DPBS
199 ml
AP反应缓冲液

Tris
100 mM

NaCl
100 mM

MgCl 2
5 mM

用NaOH
调节pH至9.5

致谢

我们感谢Jean K. Millet，Tamar Friling，Alice M. Hamilton和Whittaker实验室的所有成员进行有益的讨论。我们还感谢Collins实验室在整个研究期间提供有用的建议。

参考文献

Bussey，K.A.，Bousse，T.L.，Desmet，E.A.，Kim，B。和Takimoto，T。（2010）。 PB2残基271在哺乳动物宿主细胞中增强甲型流感病毒的聚合酶活性中起关键作用。/a> J Virol 84（9）：4395-4406。
Tse，L.V.，Marcano，V.C.，Huang，W.，Pocwierz，M.S.and Whittaker，G.R。（2013）。纤溶酶介导的大流行H1N1流感病毒血凝素激活独立于病毒神经氨酸酶。 J Virol 87（9）：5161-5169。