材料和试剂

受精鸡（Gallus gallus）
重组小鼠Dkk-1（R& D Systems，目录号：1765-DK）
肝素丙烯酸珠（Sigma-Aldrich，目录号：H5263）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
Pelikan绘画墨水黑色
Silikon Peroxid（IDEX Health& Science，目录号：SC0083ST）
钨丝（0.380mm，10FT）（World Precision Instruments，目录号：TGW1510）
具有同心圆的网格（NE42-21mm）（Graticules LTD，Tonbridge Kent）
青霉素 - 链霉素（10,000U/ml）（Gibco，目录号：15140-122）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S-3014）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P-9541）
（Prolabo，目录号：22317297）
NaH 2 PO 4 sub 2 O 2（Scharlab，目录号：SO0334）
（Prolabo，目录号：27778293）
D（+）葡萄糖酐（Prolabo，目录号：24370294）
10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）
4％来自20％PFA的多聚甲醛（PFA）（参见配方）
PBS/0.1％BSA（参见配方）
Tyrodes缓冲区（参见配方）
0.5％碳酸氢盐（见配方）
0.5％葡萄糖（见配方）
Tyrodes补充（见配方）

设备

37℃，5％CO 2强制空气培养箱（Novital，型号：Covatutto 120-4V）
解剖显微镜（Leica Microsystems，型号：MS5）
丁烷燃烧器（Butsir）
玻璃微吸盘（自制）
巴斯德吸管（Deltalab，目录号：200001）
硅管（IDEX Health& Science，目录号：SC0083ST）

程序

将受精的小鸡（Gallus gallus）在37℃下在强制空气培养箱中温育。根据Hamburger和Hamilton（1951），将小鸡胚胎发育至HH10阶段
使用本生灯制备玻璃微量移液管。将微量移液管的一侧引入硅管中，用于吸取溶液，同时拾取每个珠（图1A-D）。将钨丝连接到巴斯德吸管以轻松处理（图1E）。

图1.微滴制备。 C-D。使用巴氏吸管的紧密部分来制备微量移液管。 E.宽部件用作钨丝的手柄。
使用镊子选择性肝素丙烯酸珠基于其大小。在操作显微镜的一个目镜中插入的网格用于选择〜40μm的珠。然后，将珠在PBS中漂洗，然后在4℃下浸泡在25μg/ml的Dkk-1蛋白在PBS/0.1％BSA或PBS中的溶液中过夜（o/n）。
用剪刀制成壳体中的开口。为了在卵内复染色胚胎，通过用本生灯制造的玻璃微量移液器将印度油墨（在添加的Tyrode中以1：1稀释）注射在胚盘下。覆盖胚胎的卵黄膜在进行显微手术的地方用钨丝滑出（见视频1）。

视频1. 在卵内对鸡胚进行反纹理
将具有同心圆的网格插入手术显微镜的一个目镜中。显微外科手术中使用的工作放大率为40倍。该网格相对于胚胎定位：垂直轴遵循胚胎腹侧中线;横向轴通过两侧的视 - 间脑角定位（图2A）（Garcia-Lopez等人，2004）。
然后，使用镊子切割浸泡的珠粒以获得半珠粒。然后将它们在PBS中漂洗数次，并将一个浸泡的半珠植入胚胎的神经管的右侧（图2B）。对于对照实验中，珠子以相同的方式浸泡在PBS中

F 图2.珠粒植入程序。A.与胚胎相关的网格的示意图。 B.将Dkk-1（黑色星号）或PBS浸泡的珠子植入HH10的雏鸡胚胎的预期的带状疱疹内。缩写：Di，hypencephalon; Mes，中脑; Rh，rhombencephalon;电话，telencephalon。
当操作完成时，蛋壳中的开口用一条胶带密封，并在水平位置孵育直到选择固定的阶段。

食谱

10x PBS-磷酸盐 - 缓冲盐水
将80g的NaCl与2g的KCl，14.4g的Na 2 HPO 4，2.4g的KH 2 PO 4
用NaOH调节pH至7.4 将dH <2> O添加至1,000 ml
过滤灭菌（0.2μm）
存储在RT
20％PFA-多聚甲醛
将600ml预热的1x PBS在65℃下与200g PFA混合将PBS加入到1000 ml
用NaOH调节pH至7.4 过滤灭菌（0.2μm）
储存于-20°C
PBS/0.1％BSA 将0.1g BSA与100ml 1x PBS混合
Tyrodes缓冲区
4克NaCl
0.1克KCl
0.13g CaCl 2 ^。 2H O 0.028g NaH 2 PO 4 4 2 H 2 O 0.022g MgCl 2 。 6H 2 O 将dH 2 O加入到300ml中，灭菌并在4℃下保存
0.5％碳酸氢盐 0.5g碳酸氢钠NaHCO 3溶液将dH 2 O加至100ml，灭菌并在4℃下贮存
0.5％葡萄糖
0.5克D（+）葡萄糖酐将dH 2 O加至100ml，灭菌并在4℃下贮存
蒂罗德补充了
30 ml Tyrodes缓冲液
10ml 0.5％葡萄糖 10ml 0.5％碳酸氢盐 500μl10,000U/ml青霉素 - 链霉素

致谢

该方案改编自以前发表的Crossley等人（1996）和Vieira和Martinez，（2005）的研究，并且由Martinez-Ferre等人进行。 >（2013）。这项工作得到EUCOMMOLOLS合同261492，西班牙科技创新基金BFU-2008-00588，西班牙教育和科学部教育和科学大学教授Formrant Grant AP2009-3644，Consolider Grant CSD2007-00023，健康卡洛斯III研究所，西班牙语细胞治疗网络和心理健康研究中心，瓦伦西亚总理事会（Prometeo 2009/028和11/2011/042）和Alicia Koplowith基金会。我们感谢M.Ródenas的技术援助。

参考文献

Crossley，PH，Martinez，S.and Martin，GR（1996）。由FGF8诱导的中脑发育 380（6569）：66- 68.
Garcia-Lopez，R.，Vieira，C.，Echevarria，D。和Martinez，S。（2004）。在雏鸡胚胎的10个体节阶段的间脑和Zona极限的命运地图。 a> Dev Biol 268（2）：514-530。
Hamburger，V。和Hamilton，H.L。（1951）。鸡胚发育的一系列正常阶段。 J Morphol 88（1）：49-92
Martinez-Ferre，A.，Navarro-Garberi，M.，Bueno，C.and Martinez，S.（2013）。 Wnt信号通过调节Shar诱导在alar板中指定动脉内限制及其组织器性质。 a> J Neurosci 33（9）：3967-3980。
Vieira，C。和Martinez，S。（2005）。在与Fgf8相关的鸡神经管中MAP激酶磷酸酶-3（Mkp3）表达的实验研究活动。 Brain Res Brain Res Rev 49（2）：158-166。