材料和试剂

原代培养神经元
NMDA（Sigma-Aldrich，目录号：M3262-25MG）
Neurobasal培养基（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：21103）
LDH测定底物溶液
LDH测定染料溶液
LDH测定辅因子准备
体外毒理学测定试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：TOX-7）

设备

37℃，5％CO 2细胞培养箱
96孔板（Sigma-Aldrich，目录号：SIAL0596-50EA）
可测量490nm和690nm的96孔板的分光计（Molecular Devices，型号：SpectraMax M2e多模式微板读数器）

程序

NMDA诱导的兴奋毒性
1. 用新鲜的神经基础培养基制备新鲜NMDA 1,000x储备溶液（25mM）。旧NMDA储备溶液在诱导兴奋性毒性方面不太有效，并且可能需要更高的剂量。
2. 在NMDA处理之前，取出一半条件培养基（旧培养基），并置于培养箱中以保持温热和pH平衡。在兴奋性毒性处理后，取出的条件培养基被保存以替换含NMDA的培养基。使用条件培养基而不是新鲜培养基进行替换的原因是原代培养神经元对环境变化非常敏感，并且使用条件培养基可以在整个程序期间使对除NMDA处理之外的神经元的额外刺激最小化。
3. 将NMDA直接加入到培养基中以启动神经元的兴奋性毒性刺激。 NMDA的工作浓度为25μM。如果平板中的培养基为10ml，则将NMDA原液（25μl） mM）将为10μl的1/1000，其为10μl。治疗期间神经元保持在培养箱中。
4. 与NMDA孵育60分钟后，用新鲜的神经基础培养基（温和和pH平衡）洗涤神经元一次，然后返回到先前保存的条件培养基中。
5. 允许神经元恢复不同的时间段，范围从0小时至24小时，直到进一步的实验
6. 在6小时恢复后可观察到显着的神经元死亡，并在24小时后达到其最大水平。
  注意：条件培养基对于使神经元的应激最小化是必需的。
乳酸脱氢酶测定法检测细胞死亡
1. 在进行测定之前立即通过混合等体积的LDH测定底物溶液，LDH测定染料溶液和LDH测定辅因子制备根据Sigma制造方案制备乳酸脱氢酶测定混合物。将混合物储存在冰上。
2. 从培养箱中取出培养物。
3. 将每种条件下的大约100μl培养基分别转移到微离心管中，并以13,000rpm离心培养基1分钟以沉积细胞碎片。
4. 转移50μl培养基从每个条件到96孔板。向每个样品中加入100μl乳酸脱氢酶测定混合物。可以按比例调节培养基和乳酸脱氢酶测定混合物的体积。
5. 用铝箔覆盖板以避免曝光。
6. 根据培养基中LDH的浓度，在室温下孵育几分钟至几小时。对于第一次使用者，每20分钟读取结果以确定最佳终点是强烈推荐。为了在不同批次的培养物之间获得相当的结果，应当使用类似的终点。随着培养条件（细胞活力，细胞密度和培养基体积）的变化不同批次的神经元，有时难以使用反应时间的长度确定终点。例如，在一批神经元中，在对照组（未处理组）中在490nm处获得1.0的读数可能需要1小时;而在另一批次中，需要1.5小时。因此，强烈推荐在整个LDH反应期间每20分钟读取反应，并且只有当对照组的读数（例如，1.0±0.1）与对照组的读数相当时才收集的数据其他批次应使用。由于读数只是任意数，所以数据仅在将治疗组与其对照组比较时才有意义。
7. 分光光度法测量在490nm波长处的吸光度。测量96孔板在690nm的背景吸光度。从490nm处减去690nm的读数，以获得最终读数
8. 如果没有读板器，样品可以转移到适当尺寸的比色皿用于分光光度测量

笔记

细胞外LDH的浓度取决于细胞活力，细胞密度和培养基体积。理想情况下，不同培养孔中的细胞密度和培养基体积应完全相同，以避免结果的波动
一些培养基含有显着水平的LDH活性。在这种情况下，应测量空白培养基并从最终结果中减去。或者，在任何治疗之前，可以用无血清培养基替换含血清培养基。

致谢

这项工作由加拿大卫生研究院（CIHR），CHDI基金会，台湾卫生临床试验和研究中心（DOH102-TD-B-111- 004），台湾国家研究委员会（NSC100 -2632-B-039-001-MY3和NSC 101-2320-B-039-059-），中国国家自然科学基金31040085和81271221，以及重庆国际科技合作基金会cstc201110003。 Y.T.W.是霍华德休斯医学研究所国际学者，不列颠哥伦比亚省心脏和卒中基金会以及中风研究中的育空座椅。我们感谢李玉平，Henry Martin博士，刘丽东博士和陆杰博士的技术支持。

参考文献

Decker，T。和Lohmann-Matthes，M.L。（1988）。在测量细胞毒性和肿瘤坏死因子中定量乳酸脱氢酶释放的快速而简单的方法（TNF）活性。 Immunol Methods 115（1）：61-69。
Legrand，C.，Bour，JM，Jacob，C.，Capiaumont，J.，Martial，A.，Marc，A.，Wudtke，M.，Kretzmer，G.，Demangel，C.，Duval， et al。（1992）。培养的真核细胞的乳酸脱氢酶（LDH）活性作为细胞中死细胞数量的标记中等[校正]。生物技术 25（3）：231-243。
Liu，Y.，Wong，TP，Aarts，M.，Rooyakkers，A.，Liu，L.，Lai，TW，Wu，DC，Lu，J.，Tymianski，M.，Craig，AMand Wang，YT 2007）。 NMDA受体亚基在体外介导兴奋性毒性神经元死亡中具有不同的作用 27（11）：2846-2857。
Taghibiglou，C.，Martin，HG，Lai，TW，Cho，T.，Prasad，S.，Kojic，L.，Lu，J.，Liu，Y.，Lo，E.，Zhang， JZ，Li，YP，Wen，YH，Imm，JH，Cynader，MS和Wang，YT（2009）。 NMDA受体依赖性激活SREBP1在兴奋性毒性和缺血性神经元损伤中的作用。 em> Nat Med 15（12）：1399-1406。
Zhang，S.，Taghibiglou，C.，Girling，K.，Dong，Z.，Lin，S.Z.，Lee，W.，Shyu，W.C.and Wang，Y.T。在兴奋性中毒和缺血性神经元损伤中增加PTEN核易位的关键作用。 J Neurosci 33（18）：7997-8008。
Taghibiglou，C.，Martin，HG，Lai，TW，Cho，T.，Prasad，S.，Kojic，L.，Lu，J.，Liu，Y.，Lo，E.，Zhang， JZ，Li，YP，Wen，YH，Imm，JH，Cynader，MS和Wang，YT（2009）。 NMDA受体依赖性激活SREBP1在兴奋性毒性和缺血性神经元损伤中的作用。 em> Nat Med 15（12）：1399-1406。